药物酒炙对四物汤补血活血作用的影响研究

李卫先，刘园园，王议忆，李 达

(湖南中医药高等专科学校，湖南 株洲 412012)

四物汤是治疗血虚证的基础方剂，具有增强免疫力、补血活血的作用，在古代文献资料中均记载其既能“补血”，又具有“活血”之功。四物汤主要由当归、川芎、芍药、熟地黄四味中药组成[1]。原方源于《仙授理伤续断秘方》，但原方并未阐明方中各药所用的具体炮制品, 故本研究在探讨药物原料的炮制方法时，应该力求增强其补血活血的功能，通过对比不同炮制品组成的四物汤的补血作用，以期确证四物汤在治疗营血亏虚及血行不畅时组方中当归、川芎、白芍、熟地黄的具体炮制品。

1 材料

1.1 仪器

LBY-F6粘附仪(北京普利出品)；RA2型红细胞电泳仪(上海)；7170型日立生化分析仪；CKX41SF 倒置显微镜(OLYPUS公司出品)。

1.2 实验材料

实验所用当归、川芎、白芍、熟地等药材均由湖南中医药高等专科学校附属一医院提供，依据《中国药典》(2015年版一部)相关标准判定为合格药材。注射用环磷酰胺(Cyclophosphamide,CY),由江苏恒瑞医药股份有限公司出品,批号：06121021。黄酒(15°花雕酒,浙江绍兴湖塘酿酒厂),白酒(55°红星二锅头，北京酿酒总厂)。

1.3 实验动物

Wistar 小鼠360只，清洁级,体重18～22 g, ♀♂各半，Wistar大鼠48 只，体重为150～200 g，由中南大学湘雅医学院实验动物中心提供,动物合格证号：SCXK(湘)2016-0012。实验动物饲养于湖南中医药高等专科学校动物实验中心，自由饮用过滤净化处理水。

2 方法

2.1 样品分组及提取

2.1.1 样品分组 按《方剂学》教材规定的剂量分批称取四物汤[1]，共分6组：①第1组:各组分均为生品(熟地黄清蒸)的四物汤水煎液，药物组成：清蒸熟地黄12 g、白芍12 g、当归10 g、川芎8 g等；②第2组：各组分均为酒炙品即酒熟地黄、酒白芍、酒当归、酒川芎组方的四物汤,各药用量同A组；③第3组：熟地黄酒蒸、其他药物均为生品组方的四物汤, 各药用量同A组；④第4组：白芍酒炙，其它药物均为生品(熟地黄清蒸)组方的四物汤，各药用量同A组；⑤第5组：当归酒炙，其他药物均为生品(熟地黄清蒸)组方的四物汤,各药用量同A组；⑥第6组：川芎酒炙，其他药物均为生品(熟地黄清蒸)组方的四物汤,各药用量同A组。

2.1.2 样品提取 以上各组按量称取各药后，常温(25 ℃)浸泡30 min，加蒸馏水2 000 mL，煮沸后文火煎30 min，过滤药液，药渣加蒸馏水再煎煮25 min，合并两次滤液，浓缩至四物汤配制成生药含量为1 g/mL的提取液备用。

2.2 不同炮制品组成的四物汤补血作用实验

2.2.1 血虚动物模型外周血象 取体质量(20±2)g小鼠120只，每组有效动物数15只，♀♂各半，按性别体质量随机分成正常组，模型组，1、2、3、4、5、6组，各药物组小鼠每日灌胃给予生药10 g/kg相应药[2], 正常对照组与模型组小鼠给予等容量生理盐水。模型组及1、2、3、4、5、6组小鼠分别于给药第2日、第5日皮下注射乙酰苯肼20 mg/kg、40 mg/kg，从第5日起, 每日腹腔注射环磷酰胺40 mg/kg，连续4日。对照组小鼠同时注射等容量生理盐水，于末次给药1.5 h后观察小鼠的各项指标并眼眶取血,按文献方法计数红细胞、白细胞及血红蛋白含量、网织红细胞数骨髓有核细胞数[2]。

2.2.2 血虚动物模型骨髓有核细胞数的观察 分组给药同“2.2”项，各组于末次给药1.5 h后，取小鼠一侧股骨,以3%醋酸溶液10 mL冲洗出骨髓,计数骨髓有核细胞数。所得数据进行t检验，比较各组的差异。

2.2.3 血虚小鼠游泳时间 分组给药同“2.2.1”项，各组末次给药后30 min，将1、2、3、4、5、6各小组，正常组，模型组小鼠放入水温20 ℃水深25 cm，内壁光滑的水桶中游泳，同时用秒表记录游泳时间。所得数据进行t检验，比较各组的差异。所得数据进行t检验，比较各组的差异。

2.2.4 对血虚证小鼠体质量、脾指数、胸腺指数的影响分组给药同“2.2”项，在实验第7天称取动物体质量后，第8天颈椎脱臼处死，剖腹取肝脏、脾脏及胸腺，生理盐水冲洗，洗净血污，剥离脏器表面脂肪及结缔组织等，滤纸吸干水分，称脾脏及胸腺质量，以备用于检测脾、胸腺指数。用t检验比较各组体质量的差异。计算公式如下：脾指数=脾质量(mg)/体质量(g)；胸腺指数=胸腺质量(mg)/体质量(g)。所得数据进行t检验，比较各组的差异。

2.3 不同炮制品组成的四物汤活血化瘀作用实验

2.3.1 对血虚证血虚血瘀模型大鼠耳廓微循环血流量的影响 取体质量(150±200)g雄性大鼠80只，每组有效动物数10只，随机分成正常组，模型组，1、2、3、4、5、6组，正常对照组大鼠给予等容量生理盐水；模型组及1、2、3、4、5、6组大鼠分别于给药第2日、第5日皮下注射乙酰苯肼20 mg/kg、40 mg/kg，从第5日起, 每日腹腔注射环磷酰胺40 mg/kg，连续4日[3]。各组动物最后一次在给予环磷酰胺35 min后, 按0.3 mL/100 g腹腔注射10%水合氯醛麻醉, 用多普勒微循环检测仪检测耳廓微循环血流量。第6天始，1、2、3、4、5、6组大鼠每日灌胃给予10 g生药/kg相应药, 正常对照组与模型组小鼠给予等容量生理盐水，连续6天。第13天, 各组动物于给药30 min后，用与前同样方法检测耳廓微循环血流量。

2.3.2 对血虚证血虚血瘀模型大鼠耳廓微血管流速和管径影响 按“2.3.1”项方法分组给药，在第14天, 各组动物于给药30 min后, 按0.3 mL/100 g腹腔注射10%水合氯醛麻醉动物, 用微循环图像分析仪测耳廓微血管流速及管径。

3 结果

3.1 不同炮制方法组成的四物汤补血作用比较

3.1.1 对血虚小鼠外周血象及骨髓有核细胞的影响 与空白组比较，模型组外周血红细胞数、白细胞数、血红蛋白及骨髓有核细胞数均降低，网织细胞数均升高，差异有显著统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，不同炮制品组成的四物汤各组均能不同程度升高脾虚小鼠外周血红细胞数、白细胞数以及血红蛋白及骨髓有核细胞的含量，且均能不同程度降低网织红细胞的含量，差异有显著统计学意义(P<0.01)。其中(2、3、5组)即各组分均为酒炙品组方的四物汤组与熟地黄酒炙组方的四物汤组及当归酒炙组方的四物汤组均能显著升高脾虚小鼠外周血红细胞数、白细胞数、血红蛋白及骨髓有核细胞的含量，并能显著降低脾虚小鼠网织细胞含量，与其他各组、生品组比较，有极显著性统计学差异(P<0.05)，且第2组作用强于3组、5组，与3组、5组比较，有统计学差异(P<0.05)，表明各组分均为酒炙品组成的四物汤对于血虚证小鼠外周血象、骨髓造血功能有明显改善作用。如表1所示。

3.1.2 对脾虚小鼠游泳时间的影响 与空白组相比，模型组小鼠体温降低，游泳时间缩短，差异有显著统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，不同炮制品组成的四物汤各组均能不同程度延长脾虚小鼠游泳时间，有显著统计学差异(P<0.01)；其中，2、3、5组，即各组分均为酒炙品组方的四物汤组与熟地黄酒炙组方的四物汤组及当归酒炙组方的四物汤组均能显著延长脾虚小鼠的游泳时间，与其他各组及生品组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，且第2组作用强于3组、5组，与3组、5组比较，有统计学差异(P<0.05)，表明组分均为酒炙品组成的四物汤对于血虚证小鼠有明显的抗疲劳作用。如表2所示。

3.1.3 对脾虚小鼠脾指数、胸腺指数、体质量的影响 与空白组比较，模型组脾指数、胸腺指数、体质量均降低，有显著统计学差异( p<0.01)；与模型组比较，不同炮制品组成的四物汤各组均能不同程度升高脾虚小鼠的脾指数、体质量，有显著统计学差异(P<0.01)；其中，2、3、5组，即各组分均为酒炙品组方的四物汤组与熟地黄酒炙组方的四物汤组及当归酒炙组方的四物汤组均能显著升高脾虚小鼠的脾指数、体质量，与其他各组及生品组比较，有统计学差异(P<0.05)，且第2组作用强于3组、5组，与3组、5组比较，有统计学差异(P<0.05)，表明组分均为酒炙品组成的四物汤对于血虚证小鼠有明显的抗疲劳作用，组分均为酒炙品组成的四物汤可使血虚证小鼠免疫器官增重，对于免疫功能有改善作用，但各组脾虚小鼠的胸腺指数虽有升高趋势，与模型组比较，无统计学差异(P>0.05)。见表2。

3.2 不同炮制方法组成的四物汤活血化瘀作用比较

3.2.1 对血虚证血虚血瘀模型小鼠耳廓微循环血流量的影响 给药前, 模型组及给药各组微循环血流量与空白组比较，均具有显著统计学差异(P<0.01), 耳廓微循环血流量明显下降,血流不畅。给药后,各给药组均能不同程度增加微循环血流量，与给药前比较，有统计学差异(P<0.05)；其中,2、5、6组，即各组分均为酒炙品组方的四物汤组与当归酒炙组方的四物汤组及川芎酒炙组方的四物汤组与其他各组及生品组比较，有统计学差异(P<0.05)，且第2组作用强于5组、6组，与5组、6组比较，有统计学差异(P<0.05)，表明组分均为酒炙品组成的四物汤可明显改善血虚证血虚血瘀小鼠微循环血流量，且优于其他各组。见表2。

3.2.2 对血虚证血虚血瘀模型大鼠耳廓微血管流速的影响 模型组微动脉、微静脉流速均低于空白组, 有显著统计学差异(P<0.01), 表现为微血管血流速减慢。而给药后, 各给药组均能不同程度增加微动脉和微静脉流速,与模型组比较，有统计学差异(P<0.05)；其中,2、5、6组，即各组分均为酒炙品组方的四物汤组与当归酒炙组方的四物汤组及川芎酒炙组方的四物汤组与其他各组及生品组比较，有统计学差异(P<0.05)，且第2组作用强于5组、6组，与5组、6组比较，有统计学差异(P<0.05)，表明组分均为酒炙品组成的四物汤可显著增加微动脉和微静脉流速。见表3。

3.2.3 对血虚证血虚血瘀模型大鼠耳廓微血管管径的影响 模型组微血管管径均低于空白组，有统计学差异(P<0.05)，提示模型建立成功。而给药后, 各给药组均能不同程度扩张微血管管径,与模型组比较，有显著统计学差异(P<0.01)；其中,2、5、6组，即各组分均为酒炙品组方的四物汤组与当归酒炙组方的四物汤组及川芎酒炙组方的四物汤组与其他各组及生品组比较，有统计学差异(P<0.05)，且第2组作用强于5组、6组，与5组、6组比较，有统计学差异(P<0.05)，表明组分均为酒炙品组成的四物汤可显著增加微动脉和微静脉流速和微静脉血管管径。见表3。

组别有效动物数(只)红细胞(1012/L)白细胞数(109/L)血红蛋白(g/L)网织红细胞(个/1000RBC)骨髓有核细胞数(104/L)空白组1510.07±0.897.11±2.31151.65±8.646.31±8.64425.61±13.62模型组157.23±0.74①5.06±2.59①104.21±9.32①204.34±3.65①163.41±14.82①1158.45±0.88②6.31±1.98②125.65±9.87②95.74±3.51②285.48±10.32②21510.14±0.72②③8.19±2.14②150.94±8.32②12.16±3.41②③414.28±16.72②③3159.13±0.67②7.18±2.58②138.67±8.94②31.38±3.64②374.38±12.36②4158.75±0.59②6.53±1.67①128.23±9.67②85.57±2.81②301.45±15.96①5159.07±0.84②7.05±2.48②135.52±8.51②38.91±3.62②354.54±13.19②6158.69±0.71②6.50±2.79127.61±8.76②81.74±2.88②295.71±15.84①

注：与空白组比较，①P<0.05；与模型组比较，②P<0.01；与生品组比较，③P<0.01。

组别游泳时间(s)脾指数(mg/g)胸腺指数(mg/g)体质量(g)给药前给药7天大鼠耳廓微循环血流量(LSPU)给药前给药后空白组3842 ± 24110.38±1.692.14±0.6122.6±1.724.6±1.70.276±0.0750.284±0.087模型组2131 ± 2137.17±1.54①1.57±0.5321.8±1.218.6±1.9①0.128±0.056①0.096±0.079①13951± 268①10.54±1.67②1.61±0.5921.3±1.522.5±1.4④0.125±0.0500.195±0.085②24387 ± 236①12.98±1.38②1.91±0.6322.5±1.825.2±1.6④0.123±0.0540.312±0.076②④③34212 ± 238①11.61±1.851.74±0.5421.4±1.723.8±1.8④0.126±0.0880.198±0.067②④③44057 ± 274①10.51±1.691.63±0.6720.7±1.622.1±1.70.124±0.0680.202±0.072②④③54228 ± 263①11.58±1.541.71±0.6120.3±1.523.6±1.5④0.125±0.0650.268±0.078#②④③64046 ± 252①10.73±1.721.65±0.5222.2±1.423.9±1.30.127±0.0720.264±0.074#②④

注：与空白组比较，①P<0.01；与模型组比较，②P<0.01；与生品组比较，③P<0.01；与给药前比较，④P<0.01。

组别微动脉流速(μm·s-1)微静脉流速(μm·s-1)微动脉管径(μm)微静脉管径(μm)空白组811.3± 32.4862.4± 36.163.2± 11.442.3± 8.6模型组618.7 ± 38.2①651.2± 39.7①26.1± 10.2①18.6± 7.5①1715.6± 34.6①747.4± 32.8①38.4± 12.5①③27.8± 7.8①2821.1 ± 30.4①③868.6 ± 35.4①③63.8 ± 11.6①43.9± 6.4①③3730.6 ± 29.5①734.7 ± 37.6①43.5 ± 9.8①29.8 ± 8.3①4726.2 ± 28.6①732.3± 34.1①42.1± 12.7①28.3± 8.7①5767.4 ± 29.7①785.6 ± 33.2①53.2± 12.1①33.4± 6.8①6779.5± 36.5①791.7± 35.4①55.6± 10.8①34.7±9.2①

注： 与空白组比较，①P<0.05；与模型组比较，②P<0.01；与生品组比较，③P<0.01。

4 讨论

中医认为，血虚则脉道失于充盈，血行不畅易致血瘀，旧瘀不除则新血不生，又会导致血虚。因此，中医治疗血虚常用祛瘀生新法。四物汤是祖国医学传统的补血名方，可补血活血、化瘀生新。本方多以临床应用和药理研究报道为多，而关于四物汤炮制研究的报道则极少。中药炮制理论中，认为中药酒炙后，能增强活血散瘀、祛风通络的作用。然临床应用中亦无明确表明该方中当归、白芍、川芎等是用生品还是用酒炙品，熟地黄是清蒸还是酒蒸，是何种炮制品有效，这些都无人研究，使临床用药缺乏科学性，势必影响临床用药的有效性。本研究以血虚小鼠外周血象、骨髓有核细胞数、游泳时间、体质量、脾指数、胸腺指数、微循环血流量、微血管流速和管径为指标，对其进行了研究，从而确定方中药物是否需要酒炙。本实验以血虚小鼠外周血象、骨髓有核细胞数、游泳时间、体质量、脾指数、胸腺指数、微循环血流量、微血管流速和管径为指标，观察不同炮制方法对四物汤补血活血作用的影响。结果显示，由不同炮制品组方的四物汤均能不同程度升高脾虚小鼠外周血红细胞数、白细胞数、血红蛋白及骨髓有核细胞的含量，延长脾虚小鼠的游泳时间、增加微循环血流量、增加微动脉和微静脉流速和扩张微动脉和微静脉血管管径，但以各组分均为酒炙品组方的四物汤组作用最强。酒蒸熟地黄组方的四物汤组虽能升高脾虚小鼠外周血红细胞数、白细胞数、血红蛋白及骨髓有核细胞的含量，但其扩张模型动物微血管、增加微血管管径、加快微动脉和微静脉的血流速度作用不及酒炙当归组方的四物汤组，和酒炙川芎组方的四物汤组，及各组分均为酒炙品组方的四物汤组，酒炙川芎组方的四物汤组虽能增加微循环血流量、增加微动脉和微静脉流速和扩张微动脉和微静脉血管管径，但其升高脾虚小鼠外周血红细胞数、白细胞数、血红蛋白及骨髓有核细胞的含量作用不及酒炙当归组方的四物汤组和酒蒸熟地黄组方的四物汤组及各组分均为酒炙品组方的四物汤组。因此，四物汤临床上用于营血虚滞、出血性瘀血伴血虚或产后瘀血出血时，方中药物均需酒炙，这对临床合理使用此方，增强其临床疗效，阐明炮制对方剂的影响提供了依据，同时也验证了四物汤补血活血作用。