毫针刺“肾俞”穴对慢性肾衰模型大鼠干预作用探究*

徐艺菲，殷 磊，侯中伟

(北京中医药大学，北京 100029)

慢性肾功能衰竭(Chronic renal failure ，CRF)简称慢性肾衰，是在慢性肾脏病(Chronic kidney disease，CKD)基础上出现肾功能进行性减退直至衰竭的一种临床综合症[1]，是多种慢性肾脏及与肾脏有关疾病的最终归宿，预后不良，是威胁人类健康和生命的重要疾病之一[2-3]。中国首个慢性肾脏病流行病学的多中心调查结果显示我国慢性肾脏病总患病率为10.8%，以此估计中国有将近1.195亿CKD患者[4]。肾间质纤维化(Renal interstitial fibrosis，RIF)是导致CRF的病理学基础，是各种慢性、进展性肾脏疾病的最终归宿，其严重程度与肾功能的损坏程度密切相关。研究采用腺嘌呤灌胃法建立慢性肾衰大鼠模型[5]，传统针刺作为治疗手段，观察其对模型大鼠血液中肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)及肾间质纤维化相关指标TGF-β1的影响，探究针刺“肾俞”穴对慢性肾衰竭的治疗效果，以拓宽CRF的治疗思路和丰富CRF的治疗手段，

1 材料与方法

1.1 实验动物

40只SPF级SD大鼠，体质量(180±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号：SCXX京2016-0006)。动物按照随机数字表法分为正常组、模型对照组和针刺组，为减少数据脱落对数据造成的影响，正常组为10只大鼠，模型组和针刺组分别为15只大鼠，饲养于中日友好医院临床研究所，环境温度为20～25℃，湿度为55%左右。

1.2 药品、试剂和设备

腺嘌呤(Bioruler，批号:RH49540)，水合氯醛(Bioruler，批号:RH32027);一次性无菌针灸针(汉医，型号:18 mm×13 mm);尿素测定试剂盒(贝克曼库尔特，批号：AUZ4812);肌酐测定试剂盒(贝克曼库尔特，批号：AUZ4580);TGF-β1抗体(Affinity，AF1027);全自动生化分析仪(BECKMAN COULTER，型号:AU480);半自动石蜡切片机(莱卡，型号：RM2245);全自动脱水机(莱卡，型号：ASP200S);自动包埋机(莱卡，型号：EG1150)。

1.3 慢性肾衰模型的制备方法

本实验采用腺嘌呤灌胃法进行造模，大鼠适应性饲养5天后，将腺嘌呤与蒸馏水混合制成0.25%的腺嘌呤混悬液，按照200 mg/kg/d的剂量每日对大鼠进行灌胃，连续28天。

1.4 各组大鼠干预方法

正常组：正常饲养。

模型组：每日上午腺嘌呤灌胃造模。

针刺组：在造模开始的同时进行治疗，每日上午腺嘌呤灌胃, 下午使大鼠钻入自制鼠套，使用针灸针对双侧“肾俞”穴(取穴方法参照《实验针灸学》[6])毫针直刺，进针6 mm，留针30 min。

1.5 一般指标观察

每日观察各组大鼠精神、饮食、饮水、皮毛色泽、活动情况及垫料干湿程度并记录，每周称取大鼠体重，实验结束后称取大鼠肾脏湿重。

1.6 血液指标检测

实验结束后，采用10%的水合氯醛按照0.3 mL/100 g的剂量对大鼠进行麻醉，经大鼠心脏取血2 mL，于室温静置2 h后，以3 000 r/min离心10 min，取200 μL血清放入冻存管，采用BECKMAN COULTER全自动生化分析仪进行血常规及生化检测。

1.7 TGF-β1免疫组化染色

大鼠肾脏切片脱蜡至水，过氧化氢封闭10 min，高压抗原修复，加羊血清封闭，然后直接滴加TGF-β1一抗(浓度为1：100)，4℃过夜；次日，PBS缓冲液洗涤后；加二抗，37℃孵育30 min，然后DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片。光学显微镜下观察阳性颗粒表达情况并拍照。采用AJ-VERT imaging system0及Image Pro Plus 32 analysis system进行计算，每张切片采取5个随机视野，每个视野独立计算。

1.8 HE染色

大鼠取血后迅速取出大鼠双侧肾脏放入10%福尔马林固定，之后进行石蜡包埋，半自动切片机切成5 μm组织片，然后组织片进行常规脱蜡；梯度乙醇水化100%—90%—80%—70%; 苏木素染液10 min；酸酒精分色2 s；1%伊红染液1 min； 去离子水稍水洗；梯度乙醇脱水；70%—80%—90%—100%;二甲苯透明；中性树胶固封。光学显微镜下观察组织病变并拍照。

1.9 统计学处理

2 结果

实验过程中模型组大鼠因灌胃不当死亡1只，故样本数量少于初始数量。

2.1 各组一般形态学情况对比

实验开始第1周，各组大鼠均毛色光亮，活动灵敏，对声音和灯光敏感。从第2周开始，模型组和针刺组大鼠毛色开始稍显暗淡，出现喜蜷喜卧，饮水量增加，垫料潮湿速度加快，以上现象均呈进行性加重，两组中模型组更为明显，而针刺组大鼠经过4周治疗后，喜蜷喜卧等现象均优于模型组。

2.2 各组大鼠肾脏指数、血清肌酐和尿素氮比较

与正常组相比，模型组大鼠的肾脏指数(肾脏体重比)、Scr和BUN 含量显著升高(P<0.05)。与模型组大鼠相比，针刺组大鼠的肾脏指数、Scr及BUN显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠肾脏指数、Scr、BUN的比较

注：与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05。

2.3 各组大鼠TGF-β1表达情况比较

与正常组相比，模型组大鼠肾组织中TGF-β1表达明显增多(P<0.05)。与模型组相比，针刺组大鼠的TGF-β1表达明显降低(P<0.05)。见图1。

注：与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05。图1 各组大鼠TGF-β1平均光密度值比较

2.4 各组大鼠HE染色结果

正常组大鼠肾脏结构完整，肾小球未见萎缩，肾小管、集合管未见扩张或萎缩，无纤维组织增生和炎细胞浸润。模型组大鼠肾小管黄绿色结晶沉积及肉芽肿形成、肾小管扩张、肾小管变性/坏死、间质炎细胞浸润及间质纤维化。针刺组大鼠肾小管管腔内未见黄绿色结晶体，肾小管扩张、肾小管变性/坏死病变及纤维化均有减轻趋势。见封三彩图2。

3 讨论

中医古代文献中并无与慢性肾功能衰竭相对应的中医病名，慢性肾功能衰竭临床症状繁多，病因病机复杂，根据其临床表现及发展过程，当属中医文献中的水肿、癃闭、关格、肾劳、肾风、肾痿、溺毒、虚劳等病证范畴。众多医家均认可慢性肾衰为本虚标实之证，即慢性肾衰的发病以肾体不足为根本，邪实为标，可由外邪、饮食、劳倦、情志、药毒虫毒等外因诱发或加重。在本病发生过程中，首先存在肾体不足，或因本脏疾病所致，或因他脏疾病所累，逐渐进展至肾元虚损，肾用失司，湿浊内生，瘀毒内停，耗气伤血，更伤肾元，因虚致实，又因实更伤正，形成恶性循环。

肾俞穴(BL 23)出自《灵枢·背俞》，足太阳膀胱经经穴，别名肾腧、肾之俞、少阴俞、肾念、高盖等，为肾之背俞穴，是肾气在背部输注、转输之处。《难经·六十七难》云:“五藏募皆在阴，而俞皆在阳者，何谓也？然阴病行阳，阳病行阴。故令募在阴，俞在阳”。《素问·阴阳应象大论》云：“善用针者，从阴引阳，从阳引阴”。《素问·咳论》：“治藏者治其俞，治府者治其合”，对于五脏疾病，可选取本脏所对应的背俞穴进行治疗，即肾俞穴。

“今夫五脏之有疾也，譬犹刺也，犹污也，犹结也，犹闭也。……夫善用针者，取其疾也，犹拔刺也，犹雪污也，犹解结也，犹决闭也。疾虽久，犹可毕也”(《灵枢·九针十二原》)，“十二俞，……皆通于脏气”(《类经》)。背俞穴为调节人体脏腑功能，振奋正气之要穴,因而对于慢性肾衰本虚标实之证，肾俞穴当作为首选之腧穴。《扁鹊心书》云：“肾俞二穴，凡一切大病于此灸二三百壮，盖肾为一身之根蒂，先天之真源，本牢则不死”。肾俞穴是肾之精气聚集之处，为元气之根，能够培补并激发肾气，以助肾脏气化，促进津液代谢，升清降浊，运化得宜 。肾俞穴内应肾脏，是肾脏经气输注于背部之处，具有补肾纳气、健骨强筋、充耳益髓、固精敛涩、调经止带等多种功能。目前针对慢性肾衰的针刺治疗研究多选用整组腧穴进行治疗，少有单穴研究[7-9]。研究选毫针单独针刺大鼠双侧肾俞穴，可培补肾元、扶助正气，复其存精泄浊之用，以推动瘀浊之邪运化排出，如此则肾脏内外之精微升降运化有序，诸脏得养，印证该穴对肾脏的直接调理作用。

肾间质纤维化(Renal interstitial fibrosis，RIF)以细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)在肾间质内过度沉积和间质内肌成纤维细胞(myofibroblast，MFB)的大量增生为特征，是各种慢性肾脏疾病进展到终末期肾衰竭的共同途径和主要病理基础[10]。转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1) 是目前已知的最强的致纤维化因子，是参与间质纤维化最关键的细胞因子之一[11]。TGF-β1能够通过TGF-β1/Smad信号通路诱导肾小管上皮-间充质细胞转分化(Epithelial to mesenchymal transition, EMT)[12]，EMT是肾小管上皮细胞失去其上皮细胞表型，细胞间的连接消失，细胞骨架重新构建，细胞迁移及浸润能力增强，最终转化为间质细胞的过程[13]，是导致RIF的重要机制之一；TGF-β1通过诱导EMT激活蛋白激酶C(PKCs)、氧化应激反应[14]和肾素血管紧张素系统[15]，致使ECM关键蛋白如纤维黏连蛋白、层黏连蛋白及I、III、IV等多种胶原合成增多，最终导致ECM大量沉积于肾间质, 肾间质纤维化形成[16]。此外，TGF-β1能够诱导肾间质中成纤维细胞增殖并转化为MFB[17]，MFB是导致ECM过度分泌的主要效应细胞；还能够通过促进受损的肾小管上皮细胞凋亡引发肾小管萎缩[18]，最终导致肾间质纤维化的发生。

实验结果显示，针刺疗法能够降低模型大鼠的肾重体重比，降低肾脏肥大指数。在间质纤维化方面，针刺组的TGF-β1表达较模型组显著降低，经针刺治疗的大鼠血清中的Scr、BUN含量均明显低于模型组，说明针刺疗法能改善慢性肾衰患者的肾功能。可以认为针刺大鼠“肾俞”穴能够发挥“肾俞”穴对肾脏的直接调整作用，抑制TGF-β1在肾脏组织的表达，从而减轻ECM的堆积，改善肾脏微循环，减轻肾间质纤维化程度，进而增强肾脏功能，延缓肾衰竭进展。

慢性肾衰病机错综复杂，治疗困难，预后较差，虽然目前血液透析、腹膜透析及肾移植手术等疗法为慢性肾衰的治疗提供了新的途径，对部分患者虽可获得一定疗效，延长了患者的生命，但由于存在费用昂贵、肾源不足及各种并发症的问题，无法广泛普及。所以就目前治疗现状来说，可以考虑将中医治疗与现代医学疗法相结合，充分发挥中医整体辨证论治的特色和传统针刺简、便、验、廉的优势，从而起到减少患者痛苦、延缓疾病进展、提高生活质量、节省医疗资源的效果。