水稻秸秆预处理对猪粪高温堆肥过程中磷素形态变化的影响

2019-07-13李念念朱端卫周文兵陈焰鑫伍玉鹏

植物营养与肥料学报 2019年6期

王砚，李念念，朱端卫，周文兵，陈焰鑫,3，伍玉鹏*

（1 华中农业大学资源与环境学院，武汉 430070；2 农业农村部长江中下游耕地保育重点实验室，武汉 430070；3 生猪健康养殖协同创新中心，武汉 430070）

磷 (P) 是植物必需的营养元素之一，而中国有74%的耕地土壤缺磷，化学磷肥的当季利用率也仅为10%～25%，是作物产量的重要限制因子[1]。为了提高作物产量，往往需要大量施用磷肥，这与我国的磷矿资源开采速度形成了尖锐的矛盾。有机废弃物中含大量磷素，以猪粪为例，其中磷元素约为猪粪干物质的6.45%[2]。据中华人民共和国国家统计局数据，2016年底我国饲养猪43503.71万头，全年所排泄粪便折算成标准磷肥约为93.03万t。通过堆肥将新鲜猪粪转变为有机肥进行农田施用，不仅避免了畜禽粪污带来的环境污染，也实现了猪粪中磷等营养元素的再次利用，对缓解磷肥供需矛盾具有十分重要的意义，也符合农业部《到2020年化肥使用量零增长行动方案》的要求。

磷作为堆肥中比较稳定的营养成分，其绝对含量通常不会随着堆肥发酵的过程而出现明显变化，但有机物中难被植物吸收利用的磷可以随有机物的腐解转变成植物较易吸收的形态，进而提高磷的有效性及作物利用率[1,3-5]。普遍认为，磷形态的转变可归结于堆肥过程中碳素通过生物转化产生的大量有机酸类物质，其中小分子有机酸中的多元酸类物质(琥珀酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸等) 对难溶性磷具有较强的溶解能力，而大分子的腐殖酸类物质对难溶性磷也有一定的络合能力[5-7]。

作物秸秆由于其较高的C/N，可为畜禽粪便堆肥提供充足的碳素来源，也可用来平衡堆肥的总C/N、调节堆肥孔隙率与含水率，对堆肥品质起着非常重要的作用[8]。然而，秸秆中的纤维素、半纤维素和木质素限制了秸秆的分解过程，延缓了畜禽粪便与秸秆混合堆肥的整体速度[9-11]。利用秸秆预处理技术解除不利于秸秆分解的限制因素，是加速秸秆分解，提高秸秆与畜禽粪便混合堆肥效率的关键[10-12]。已有研究证明，利用碱处理或生物处理方式进行秸秆预处理后加快了秸秆与畜禽粪便混合发酵的效率[11,13-17]，但对这一过程中磷素形态转变的研究却较少。

为进一步明确秸秆预处理在加快堆肥效率的同时，是否也能对堆体中磷的转化产生影响，本研究分别用氢氧化钙和秸秆腐熟剂对水稻秸秆进行化学的和生物的预处理，与猪粪按比例混合进行堆肥，并参照Dou等[18]的连续浸提法对不同时期堆肥磷的形态进行分级测定。通过比较不同处理下堆体中磷形态的动态变化过程，探索不同秸秆预处理方式对提高堆肥产品磷有效性及作物利用率的作用，以期优选出对猪粪-水稻秸秆混合堆肥有利的秸秆预处理方式，为提高农业废弃物的利用率提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

农田收集水稻秸秆，粉碎成1～3 cm小段备用，其含水率为5.9%、碳含量为405 g/kg、氮含量为5.10 g/kg、磷含量为4.49 g/kg、钾含量为0.83 g/kg、C/N为79.3。

猪粪收集自武汉市新洲区某养猪厂，其含水率为73.1%、全碳含量为359 g/kg、全氮含量为31.0 g/kg、全磷含量为12.6 g/kg、全钾含量为12.5 g/kg、C/N为11.59。

秸秆腐熟剂购买自湖北启明生物工程有限公司，主要成分包括芽孢杆菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等多种微生物及其胞外酶，有效活菌数 ≥200亿/g。

1.2 试验设计

采用双因素设计开展试验，分别用化学和生物方式对水稻秸秆进行预处理，未经任何处理的水稻秸秆设置为对照。随后，利用预处理过或未经预处理的秸秆分别与猪粪混合进行堆肥。因此，本研究共设置四个处理和一个对照，但由于试验体系较大，每个处理仅设置两个重复。

水稻秸秆预处理：分别称取4 kg水稻秸秆，调节水分70%左右，按照试验设计进行预处理。其中化学预处理为水稻秸秆 + 5%氢氧化钙静态堆置10 d(C1) 或20 d (C2)；生物预处理为水稻秸秆 + 1%尿素 +0.5%秸秆腐熟剂静态堆置10 d (B1) 或20 d (B2)；对照 (CK) 为水稻秸秆不经任何处理。秸秆预处理静态堆置是利用50 L塑料桶在温度相对恒定的室内进行(全天室温22～29℃)，塑料桶未采取保温措施。其中生物预处理按照秸秆腐熟剂使用说明加入尿素，目的是为微生物提供氮源。为消除生物预处理中添加尿素带来的影响，化学预处理和对照在与猪粪混合堆肥时加入等量尿素。经过预处理后，B1、B2、C1和C2秸秆的全氮含量分别为4.60、8.70、5.60和7.13 g/kg，全磷含量分别为9.62、10.78、6.29和6.57 g/kg。

堆肥管理：利用自制的保温桶 (80 L大桶套50 L小桶) 在室内开展为期38 d的发酵实验。大、小桶之间通过塞入保温材料来维持堆肥温度的相对恒定。通过无损转移的方式分别将预处理过或未处理的水稻秸秆与28 kg猪粪 (水稻秸秆与猪粪原始质量比为1∶7) 混合均匀，调节水分含量至55%后放入保温桶中进行堆制，并以此命名为B1、B2、C1、C2和CK组 (与水稻秸秆的预处理相对应)。在堆肥过程中，根据堆体的实际情况，高温期每1～3天进行一次人工翻堆，降温期则每5天进行一次人工翻堆。

1.3 取样及测定

分别在水稻秸秆预处理前后，利用超高分辨率场发射扫描电子显微镜 (SU8010，HITACHI，日本)进行电镜扫描 (SEM)；利用FTIR光谱仪 (VERTEX 70，BRUKER，德国) 进行红外光谱 (IR) 分析；利用X射线衍射仪 (D8 ADVNCE，Bruker，德国) 进行X-射线衍射 (XRD) 分析。

在堆肥开始后的第0、7、13、23和38 天采集堆肥样品。采样前翻堆并充分搅拌均匀，五点采样后混合缩分保留200 g样品，其中100 g作为鲜样保存于4℃的冰箱中，另外100 g置于室内风干，磨细过0.15 mm筛 (100目)。堆肥温度通过插于堆体中心的温度计和室内温度计记录。

堆肥风干样通过H2SO4-H2O2消煮完全后，利用钼锑抗比色法测定全磷 (TP)。堆肥磷形态的分级测定参照Dou等[18]的连续浸提法进行，鲜样逐步加入去离子水、0.1 mol/L NaHCO3、0.1 mol/L NaOH 和1 mol/L HCl 振荡浸提，提取出堆肥中稳定性由弱到强的各级磷素形态，即H2O-P、NaHCO3-P、NaOH-P和HCl-P。每步所得上清液的无机磷 (Pi) 直接用钼蓝比色法测定，总磷 (Pt) 用K2S2O8氧化—钼蓝比色法测定，总磷和无机磷差减法得到上清液中有机磷 (Po)含量[19]。最后一种形态浸提结束后，将滤膜上的残留物与离心管中的沉淀转入消化管中，180℃蒸发至干，H2SO4-H2O2消化后测定残留态磷 (Residues-P)[20]。

1.4 统计与分析

在堆肥结束后计算分级测定磷组分方法的磷回收效率，计算公式为：

所有试验数据均以均值表示，采用SPSS 17.0(IBM，USA) 统计软件对不同处理进行相关的统计分析、显著性检验等。

2 结果与分析

2.1 不同预处理方式对水稻秸秆结构的影响

扫描电镜 (SEM) 显示 (图1a)，原始水稻秸秆叶表皮有较多的硅化细胞，表面平滑无微孔，内部结构无裸露。经过预处理后，水稻秸秆表面的球状结构明显缩小，其中秸秆腐熟剂处理的水稻秸秆细胞壁被破坏并导致内部组织暴露，且时间越长效果越好。而氢氧化钙处理的水稻秸秆虽然结构也有一定程度的破坏，但其内部组织暴露相对较少。红外光谱 (IR) 分析显示 (图1b)，不同预处理方式并未造成秸秆中纤维素的损失 (3300～3500/cm和2915/cm处的峰强度变化不大)[20]，也未显著改变纤维素大分子结构 (1431/cm和1163/cm处的峰强度变化不大)[21]，但破坏了羰基 (C=O) 键 (1732/cm的吸收峰在预处理后明显减弱)[22]，且破坏了木质素与纤维素、半纤维素之间的连接键 (1235/cm的吸收峰在预处理后明显减弱)[23]。XRD图谱显示 (图1c)，不同预处理方式均减弱了秸秆中纤维素的结晶度。随着时间的延长，秸秆腐熟剂处理的水稻秸秆纤维素结晶度进一步减弱，而氢氧化钙处理组可能由于时间延长导致氢氧化钙生成碳酸钙 (29.4θ°)，反而增加了纤维素的结晶度。总体来看，秸秆腐熟剂进行预处理的效果优于氢氧化钙预处理的效果，使其在堆肥过程中更容易被微生物分泌的纤维酶水解为小分子化合物而得到充分利用。

图1 水稻秸秆预处理前后扫描电镜 (a) 分析、红外光谱 (b) 分析和X-射线衍射分析 (c)Fig.1 SEM image (a), infrared spectra (b) and XRD analysis (c) before and after the rice straw pretreatments

2.2 不同水稻秸秆预处理方式对堆肥过程温度变化的影响

堆体温度是微生物活动及物料氧化综合作用的结果，是评价堆肥腐熟程度的一个重要指标[8]。有机物在堆体温度的升降过程中完成分解并实现堆肥的腐熟。本研究中不同处理均在堆置完成后快速升温至70℃进入高温堆肥期，并从14天开始降温，其中B1、B2温度下降最快，C1、C2略慢，而CK则保持较长一段时间的高温后才开始下降 (图2)。翻堆后堆体温度再次上升，其中B1和B2的温度上升剧烈，至25天后进入腐熟阶段，C1、C2与CK则分别在第33天、33天与38天陆续进入腐熟阶段。总体来说，生物处理水稻秸秆可缩短堆肥高温期，促进水稻秸秆与猪粪混合堆肥的进程，而化学处理则并无明显效果。

图2 不同预处理方式堆肥过程中温度的变化Fig.2 Temperature variations during process of composting with different pretreatments

2.3 不同水稻秸秆预处理方式对堆肥结束后各级形态磷、总磷含量及磷回收率的影响

堆肥结束后，不同处理的总磷含量在22.51～32.88 g/kg之间，其中利用秸秆腐熟剂进行预处理的堆体总磷含量最高，且预处理时间越长效果越明显(表1)。类似的结果已有大量报道，如Goyal和Sindhu[24]、Gaind[25]均发现在堆肥过程中接种真菌后堆肥产物的总磷含量更高，并归结于接种的微生物加快了堆体中有机物质的矿化，使得其中的碳转化为CO2而损失，氢转化为H2O而损失，氮转化为NH3而损失，只有磷保留在了堆体中并因为“浓缩效应”而含量升高。本研究不同于已有研究的地方在于微生物接种于秸秆预处理的静态堆置阶段，而非混合堆肥阶段，这在一定程度上能够避免堆肥过程中高温阶段 (本研究各处理在实验开始后均迅速进入高温期) 对接种微生物活性的抑制作用，也可以避免接种微生物与原有土著微生物的竞争作用，更大程度的发挥接种微生物对木质素等难分解物质的分解作用。需要注意的是，静态堆置阶段合适的条件也导致了秸秆一定程度的自然发酵，尤其是接种秸秆腐熟剂的处理在提供额外微生物的同时还补充了氮源，这一点可以在静态堆置结束后B1和B2秸秆TP含量较CK有大幅提升得到证明。另一方面，预处理对秸秆原有结构的破坏作用使得其在与猪粪混合堆肥过程更容易被微生物所分解利用，促进了堆肥的进程 (图2)，进而通过“浓缩效应”[26]提高堆体的全磷含量。

采用磷形态分级方法计算的回收全磷较实测全磷略低，回收率为89.76%～97.85% (表1)，与Gagnon等[21]的研究结果一致。虽然不同处理各形态磷含量差异较大，但整体来看各形态总磷含量高低依次为 HCl-P ＞ NaHCO3-P ＞ H2O-P ＞ NaOH-P，这与已有文献[19,22]的结果相似，说明有机物料中的磷大部分更容易被如HCl等强浸提剂提取。Pagliari和Laboski[23]认为，H2O-P + NaHCO3-P为植物可以吸收或随水流失的形态，而被强酸浸提剂提取态磷为不易被植物利用或随水流失的形态。从本研究来看，B1和B2堆体中的有效磷 (H2O-P + NaHCO3-P) 含量分别为14.44和13.74 g/kg，C1和C2为12.27和12.02 g/kg，CK则为11.62 g/kg。这说明秸秆预处理有利于提高堆肥产品中植物有效性磷的含量，且利用秸秆腐熟剂进行水稻秸秆混合猪粪堆肥的预处理要优于氢氧化钙。但本研究中不同处理间易利用磷占总磷的比例则无明显区别。Wei等[20]发现，接种解磷细菌后能够大幅提高堆肥产品的有效磷含量，并归结为接种菌与堆体中土著菌的协同作用。但在本研究中，腐熟剂中微生物的主要功能为促进秸秆中木质素、纤维素等难分解物质的分解，对于磷转化发挥的作用较小，这可能是不同处理间不同磷组分占全磷比例差异不大的主要原因。

2.4 堆肥过程中不同水稻秸秆预处理方式下各级形态磷含量的动态变化趋势

水浸提磷是植物吸收磷素的最直接来源[24]。图3显示，除CK和C2外，各处理样品中的H2O-Pi含量整体上呈先下降后升高的趋势。不同处理的H2O-Po含量变化同样为先降低后升高。这一变化说明堆肥中期对H2O-P的累积有抑制作用，这可能与微生物的利用有关。一般认为，堆体起始阶段由于堆制初期原料中易被微生物利用的物质较多，加快了微生物的繁殖和新陈代谢进程。而水浸提磷作为活性磷极容易被微生物所直接利用[17]，从而导致初期堆肥中水浸提磷含量呈下降趋势。随后，堆体中易分解和部分较容易分解的有机物消耗殆尽时，微生物活动减弱，加之堆肥过程中的“浓缩效应”[26]和所产生有机酸较强的溶解难溶磷的能力[27]，H2O-P含量逐渐升高。本研究中对水稻秸秆进行生物预处理后有利于其中的纤维素、木质素、半纤维素水解形成大量的易分解有机物，加快堆体中有机物的降解，从而导致水稻秸秆预处理样品中H2O-P含量变化更为剧烈。而CK中H2O-Pi含量的持续下降可能归结为堆肥过程中无机磷向有机磷的转化[28]。总体来看，秸秆预处理中H2O-Pi含量占总H2O-P含量的百分比要高于对照 (表1)，说明秸秆预处理有助于有机物料中水浸提磷的矿化，提高有机物料中磷的有效性。需要注意的是，水稻秸秆预处理组在堆肥开始的H2O-P的含量大多低于CK，说明预处理不利于初期H2O-P的保留，其原因可能是水溶性磷在预处理静态堆置时随渗滤液流失，这将会造成堆肥产品活性磷素的损失。从预处理方式来看，氢氧化钙预处理造成的H2O-P损失量大于生物预处理，从预处理时间来看，时间越长，H2O-P损失量越大。

表1 堆肥结束后不同处理各形态磷含量 (g/kg) 及磷回收率 (%)Table 1 Content of phosphorus fractionations in composts and phosphorus recovery with different pretreatments at the end of composting

图3 不同处理堆肥过程中不同分级磷形态的变化Fig.3 Changing of sequentially extracted P fractions from differently pre-treated rice straws during the composting

碳酸氢钠提取磷是由吸附于多晶磷化合物、倍半氧化物或碳酸盐表面的无机磷 (NaHCO3-Pi) 和有机磷 (NaHCO3-Po) 组成，属于植物易吸收的磷源[29]。各处理NaHCO3-Pi和NaHCO3-Po的含量随堆肥时间的延长均呈上升趋势，这可归结于堆肥的“浓缩效应”[26]。秸秆预处理样品中的NaHCO3-P含量在整个堆肥期均要高于CK，但如对比堆肥起始和堆肥结束的增加量，秸秆预处理样品和CK则并无显著差别。这说明秸秆预处理在静态堆置阶段能够释放来源于秸秆的磷从而增加NaHCO3-P的含量，但对堆肥过程中NaHCO3-P的累积却作用不大。相比于氢氧化钙预处理，秸秆腐熟剂处理样品的NaHCO3-P含量要更高一些，一方面可能是秸秆腐熟剂处理对秸秆的破坏程度更大，更有利于微生物的繁殖，而微生物磷 (MBP) 是NaHCO3-Po的主要来源[30]，另一方面也可能是氢氧化钙引入的钙离子和磷通过堆肥反应生成磷酸二钙、磷酸八钙和羟基磷酸钙等难溶解态的化合物[3]。然而，秸秆预处理对NaHCO3-Pi和NaHCO3-Po在NaHCO3-P中的占比并无显著影响(表1)。研究表明，水浸提磷和碳酸氢钠提取磷可占畜禽粪便的48%～87%，同作为高活性磷都是植物易利用养分的主要来源[31]。从这一点上来看，秸秆腐熟剂进行水稻秸秆混合猪粪堆肥的预处理方式显然要优于氢氧化钙预处理。

氢氧化钠提取的无机磷 (NaOH-Pi) 和有机磷(NaOH-Po) 与无定形结晶铝、铁磷酸盐以及胡敏酸和富里酸结合的磷有关，属于中活性磷，用于磷的长期转化，对植物有一定的有效性[32]。NaOH-P能向H2O-P和NaHCO3-P水解，也能朝HCl-P固定[28]。不同处理NaOH-Pi的含量均随堆肥的进行呈上升趋势，而NaOH-Po含量则均随堆肥的进行呈先下降后上升的趋势。在整个堆肥过程中，秸秆腐熟剂处理组样品的NaOH-P含量均高于其他处理，而氢氧化钙处理组的NaOH-P含量则与CK差别不大。从NaOH-Pi在NaOH-P中的占比来看，秸秆预处理要高于对照，且利用秸秆腐熟剂处理的样品要显著高于其他处理 (表1)，这说明秸秆腐熟剂处理后能够促进NaOH-Po的矿化，这可能有利于NaOH-P的转化，并提高其植物有效性。

HCl提取的磷主要是钙结合P，对植物的有效性较低[29]。各处理中HCl-Pi的含量整体上均呈上升趋势。第0天可以看出秸秆预处理能增加HCl-Pi的含量，并且生物预处理的效果要好于氢氧化钙预处理。各处理中HCl-Po含量均呈波动上升的趋势，其中B1、B2在第7天忽然降低，说明秸秆腐熟剂处理水稻秸秆的堆肥中，高温能够促进HCl-Po转化为其他形态的磷，且预处理时间越长越利于这种反应，而在氢氧化钙预处理组和对照组，高温影响相对不明显。

相对于未经预处理的秸秆，生物方式对秸秆进行预处理后均提高了堆肥结束后堆体中的H2O-P、NaHCO3-P、NaOH-P和HCl-P的含量，但处理时间长短对除HCl-P外的磷形态含量影响并不大。化学方式对秸秆进行预处理后则主要提高了堆肥结束后堆体中的NaHCO3-P和HCl-P含量，且处理时间越短效果越明显。化学预处理并未明显改变堆肥结束后堆体中的NaOH-P含量，但在一定程度上降低了H2O-P的含量。

2.5 堆肥过程中不同水稻秸秆预处理方式下有机、无机态总磷含量的动态变化趋势

图4显示，虽然各处理有机磷含量在堆肥初期变化并不明显，其中B1、B2在第7天有小幅下降，CK在第13天有小幅下降，但B1、B2有机磷含量在第13天开始快速增长，而CK在第23天有机磷含量也开始增加。这一趋势与赵晶晶等[33]的报道一致，即堆肥初期有机磷主要来源于易分解的猪粪，猪粪中磷脂、核酸等易分解的活性有机磷矿化为无机磷，使得堆肥中有机磷含量下降，随后堆肥中腐殖化过程和微生物对无机磷的吸收转化持续进行，与腐殖酸络合的磷酸盐和微生物量磷不断增加，堆肥中有机磷含量缓慢上升。在本研究中，相比对照，利用秸秆腐熟剂预处理水稻秸秆显然加快了这一过程的进行，即提前了堆体中有机磷含量下降和增加的时间，且堆肥结束后其有机磷含量也要显著高于对照，但不同预处理时点之间并无显著差异。氢氧化钙预处理水稻秸秆对堆肥过程中有机磷含量的影响比较复杂，如C1中有机磷含量在上升过程中第23天有一个忽然的下跌，C2处理则先下降后上升，这可能和氢氧化钙引入的钙离子有关[3]，但其机理需进一步研究。整体来看，堆肥过程中各处理无机磷含量均呈增加趋势，这可归结为堆肥过程的“浓缩效应”[26]。堆肥结束后秸秆腐熟剂处理组的总无机磷含量最高，要显著高于对照，而氢氧化钙处理组仅C1显著高于对照，这可能与氢氧化钙预处理对秸秆的破坏程度小于秸秆腐熟剂有关。