枳椇子乙酸乙酯部位抗肿瘤活性成分筛选△

张奇，刘英，胡海峰*，吴春珍，姜锦锦，李彻

1.上海医药工业研究院，上海 200040；2.国药集团健康产业研究院有限公司，上海 201203

枳椇子为鼠李科植物枳椇HoveniaacerbaLindl.的成熟种子。中医认为枳椇子具有解酒毒、护肝、止吐、利大小便的功效，枳椇子已有上千年的使用历史，目前已被卫生部药品标准收载[1-2]。药理研究表明，枳椇子具有抗肿瘤、降糖、降压、利尿、抗脂质过氧化等功效[3-5]。

嵇扬等[6]发现枳椇子水提物不仅可以抑制肝癌细胞株Bel-7402的增殖，通过动物实验证明了枳椇子水提物在体内具有一定的抑瘤效果。Ammar等[7]实验表明枳椇子水提物可以有效降低白血病细胞系K562的氧化应激水平并诱导细胞凋亡。众多研究表明枳椇子可以有效调节慢性酒精性肝损伤模型大鼠海马单胺类神经递质及代谢，并对酒精性肝损伤大鼠肝脏合成功能具有一定的保护作用[8-10]。

1 仪器与材料

1.1 仪器

FD8-3冷冻干燥设备(西盟生命科技有限公司)；CO2培养箱(Thermo)；SE602F型电子天平(奥豪斯仪器有限公司)；ZHJH-C11115B超净工作台(智诚设备有限公司)；Avanti J-26 XP离心机(贝克曼库尔特有限公司)；Ti-s恒温水浴锅(尼康)。

1.2 材料

枳椇子购自亳州市常富药业有限公司，产地为安徽亳州，经上海医药工业研究院吴春珍教授鉴定为鼠李科植物枳椇HoveniaacerbaLindl.的成熟种子。

300～400目硅胶、薄层色谱硅胶板(青岛海洋化工有限公司)；乙醇、甲醇、乙酸乙酯、石油醚、磷酸(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)；胎牛血清、DMEM培养基、1640培养基、青霉素-链霉素混合溶液(sigma公司)；肾癌细胞株OS-RC-2、结肠癌细胞株HCT-116、肝癌细胞株Huh-7、胰腺癌细胞株CFPAC-1(上海生命科学研究院)；小鼠肝癌细胞(H22，上海医药工业研究院药理评价中心)。

1.3 动物

SPF级ICR小鼠，培养于SPF级实验动物环境，96只，雄性，体质量19～21 g，许可证号：SCXK(沪)2013-0016。

2 方法及结果

2.1 提取

称取经干燥粉碎后的枳椇子粉末2.0 kg，60%乙醇水回流提取2次，经石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯依次萃取，得到枳椇子乙酸乙酯萃取物16.4 g。

2.2 枳椇子乙酸乙酯部位的分离纯化

称取10.0 g枳椇子乙酸乙酯样品，加入少量甲醇搅拌溶解，将溶解后的甲醇溶液缓慢倒入10.0 g硅胶中，随后将硅胶烘干为粉末状。称取150.0 g 300～400目硅胶装入硅胶柱中，倒入拌有枳椇子乙酸乙酯样品的硅胶干粉，压实后用500.0 mL石油醚进行淋洗。淋洗完毕后进行梯度洗脱[石油醚-乙酸乙酯(10∶1～1∶10)，乙酸乙酯-甲醇(10∶1～1∶10)]，利用薄层色谱硅胶板判断洗脱液组分，合并相同组分的洗脱液减压浓缩[11]，最终得到12个组分(Ⅰ～Ⅻ)。

用少量DMSO溶解上述12个组分，加入培养基进行稀释，制得含药培养基，质量浓度分别为1000、100、10、1、0.1 μg·mL-1(DMSO低于0.5%)。将肾癌细胞株OS-RC-2、肝癌细胞株Huh-7复苏并传3代，使细胞达到适合的细胞密度。将细胞均匀铺于96孔板，放置CO2培养箱中过夜培养，使细胞充分贴壁。次日，吸出培养基，加入含药培养基与含有相应浓度DMSO的对照培养基，并设3复孔。CO2培养箱中培养48 h后加入10 μL/孔MTT溶液(5 mg·mL-1)，37 ℃孵育4 h，取出96孔板吸出培养基，每孔加入100 μL DMSO，振荡30 min，使甲臢晶体充分溶解，测定波长为570 nm处的光吸收值并计算半数抑制率(IC50)。实验结果见表1，结果标明枳椇子乙酸乙酯部位硅胶分离的第Ⅳ段具有较强的体外抗肿瘤活性。

表1 枳椇子乙酸乙酯部位硅胶分离各段对肿瘤细胞的增殖抑制作用 μg·mL-1

2.3 枳椇子抗肿瘤化合物活性筛选及结构鉴定

2.3.1 枳椇子抗肿瘤化合物活性筛选 使用制备级高效液相色谱仪将第Ⅳ段进行分离纯化，流动相A泵为甲醇-0.1%甲酸水溶液(1∶9)，B泵为甲醇-0.1%甲酸(7∶3)。将出峰时间相同的成分接样，合并，利用C18固相萃取柱进行脱磷酸处理后50 ℃旋蒸浓缩。得到4种白色结晶粉末ZJZ-Z1(126.0 mg)、ZJZ-Z2(1 968.1 mg)、ZJZ-Z3(72.2 mg)、ZJZ-Z4(31.8 mg)。

将上述4个化合物用DMSO溶解后加入培养基稀释，质量浓度为1000、100、10、1、0.1 μg·mL-1(DMSO低于0.5%)。将肾癌细胞株OS-RC-2、结肠癌细胞柱HCT-116、肝癌细胞株Huh-7、胰腺癌细胞株CFPAC-1复苏并传3代，使细胞达到适合的细胞密度。将细胞均匀铺于96孔板，放置CO2培养箱中过夜培养，使细胞充分贴壁。次日，吸出培养基，加入含药培养基与含有相应浓度DMSO的对照培养基，并设3复孔。CO2培养箱中培养48 h后加入10 μL/孔MTT溶液(5 mg·mL-1)，37 ℃孵育4 h，取出96孔板吸出培养基，每孔加入100 μL DMSO，振荡30 min，使甲臢晶体充分溶解，测定波长为570.0 nm处的吸光度值并计算IC50。实验结果见表2。

其中ZJZ-Z2对OS-RC-2、Huh-7、HCT-116、CFPAC-1的体外抑制活性较好，IC50分别为33.8、63.9、46.8、55.1 μg·mL-1。

2.3.2 枳椇子抗肿瘤化合物结构鉴定 ZJZ-Z2为白色针状晶体，易溶于乙酸乙酯、DMSO、甲醇、乙醇，难溶于石油醚、三氯甲烷。三氯化铁反应呈阳性，盐酸-镁粉反应呈阳性，表明ZJZ-Z2可能为含有酚羟基的黄酮类化合物；Molish反应呈阴性，表明化合物ZJZ-Z2中不含糖。

ZJZ-Z2紫外可见吸收光谱显示的最大吸收波长为290.5 nm，ESI-MS正离子图谱中出现m/z321.18的分子离子峰，提示ZJZ-Z2的分子量可能约为320。该化合物在13C-NMR(D2O，150 MHz)检测中发现13个碳信号峰，其中δ147.28、δ108.13处的碳信号高度约为其他同类碳信号高度的2倍，推测ZJZ-Z2可能存在对称结构；DEPT90谱表明，该化合物含有5个次甲基信号(δ108.13、97.79、96.77、85.66、74.10)，+1H-NMR谱(D2O)含有6个信号峰。结合相关文献对比分析[12-14]，ZJZ-Z2与二氢杨梅素(Dihydromyricetin)的物化性质及波谱数据基本一致，其分子式为C15H12O8，ZJZ-Z2与二氢杨梅素的1H-NMR、13C-NMR数据对比见表3，结构式见图1。

表3 ZJZ-Z2的1H-NMR与13C-NMR数据

注：二氢杨梅素核磁测试溶剂为DMSO-d6，ZJZ-Z2核磁测试溶剂为D2O，由于溶剂效应各信号峰位置出现少许偏差。图1 ZJZ-Z2的化学结构

2.4 ZJZ-Z2体内抗肿瘤活性

2.4.1 小鼠瘤块接种 用无血清的1640培养基将小鼠肝癌细胞株H22稀释为1×107个/mL，抽取0.5 mL细胞悬液接种至ICR小鼠腹腔，9 d后从腹腔抽取瘤细胞腹水，1000 r·min-1离心，吸弃上清液，用0.9%氯化钠溶液洗涤、离心两次，加入0.9%氯化钠溶液稀释至密度为1.0×106个/mL。抽取0.2 mL细胞悬液，接入小鼠左腋下，建为H22小鼠肿瘤模型[6]。

(1)

表4 ZJZ-Z2对H22荷瘤小鼠体质量和瘤质量的影响

注：与正常组比，△P<0.05，△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；下同。

表5 ZJZ-Z2对荷瘤小鼠脏器指数的影响 %

如表4所示，ZJZ-Z2对H22荷瘤小鼠表现出较好的抑瘤效果，低、中、高3个剂量组对比，中、高剂量组的抑瘤率明显高于低剂量组，中剂量组对肿瘤的抑瘤率略高于高剂量组。实验结果表明顺铂与ZJZ-Z2对小鼠的体质量产生一定影响；如表5所示，与模型组和正常组相比，给予ZJZ-Z2的各组肝脏指数明显较小，表明ZJZ-Z2具有一定的肝毒性；高、中、低3个剂量组的脾脏指数随着给药剂量的上升呈下降趋势，可能说明ZJZ-Z2具有一定的脾脏毒性，而高剂量组脾脏损伤相对于中剂量组较大，导致免疫机能受到抑制，这可能是高剂量组对H22小鼠肿瘤模型抑瘤效果不如中剂量组的原因之一。

3 讨论

本研究通过60%乙醇提取和乙酸乙酯萃取的方式制备了枳椇子乙酸乙酯部位；使用300～400目硅胶将枳椇子乙酸乙酯部位分离富集为Ⅰ～Ⅻ段收集物，通过MTT法筛选发现其中第Ⅳ段具有最强的体外抗肿瘤活性，对各肿瘤细胞的IC50为200～400 μg·mL-1；使用制备液相色谱仪将该第Ⅳ段收集物进行分离富集得到4个化合物，分别为ZJZ-Z1、ZJZ-Z2、ZJZ-Z3、ZJZ-Z4，其中ZJZ-Z2具有最强的体外抗肿瘤活性；通过对ZJZ-Z2理化性质及波谱数据的分析，并与相关文献进行对比初步判定ZJZ-Z2为二氢杨梅素；通过H22荷瘤小鼠实验，发现ZJZ-Z2对肿瘤组织表现出较强的抑瘤活性，其中ZJZ-Z2中剂量组的抑瘤率为81.35%。本研究首次发现二氢杨梅素可能是枳椇子乙酸乙酯部位中主要的抗肿瘤活性成分，此为枳椇子抗肿瘤药物与产品的开发奠定了基础。