犊牛大肠杆菌病的诊断与防治

高晶萍 李珮瑶 王存连 张瑞华 范玉堂 程智慧 徐彤

摘  要：目的：确定内蒙古某奶牛场初生犊牛发生腹泻并导致严重死亡的病因，以便针对性采取有效的防控措施。方法：采集发病死亡犊牛的肺、肝、肾、脾、淋巴以及小肠，无菌操作进行细菌分离鉴定;分离菌株纯培养后进行动物致病性试验和药敏试验。结果：在送检3例犊牛肝脏、脾脏及小肠接种培养基上，具有大肠杆菌菌落的典型特征，生化鉴定为大肠杆菌;在1例犊牛肺接种培养基上分离1株符合绿脓杆菌的菌落特征，生化鉴定为绿脓杆菌。致病性试验显示，大肠杆菌肉汤培养物接种小鼠腹腔后24h内全部死亡;绿脓杆菌菌株肉汤培养物也导致接种小鼠在48h死亡。药敏试验结果显示，大肠杆菌对阿米卡星、头孢哌酮和头孢吡肟敏感;对诺氟沙星、庆大霉素、复方新诺明、新霉素、妥布霉素、环丙沙星耐药;绿脓杆菌对头孢吡肟、诺氟沙星、妥布霉素、庆大霉素和头孢哌酮敏感，对复方新诺明、新霉素、妥布霉素、环丙沙星耐药。结论：大肠杆菌是引起该场犊牛腹泻死亡的主要病原菌，在抵抗力下降的情况下，部分犊牛继发感染了绿脓杆菌，也是导致死亡的原因之一。

关键词：犊牛腹泻;大肠杆菌;分离鉴定;药敏试验;防治

中图分类号 S858.23 文献标识码 A文章编号 1007-7731（2019）11-0085-3

犊牛腹泻是犊牛常发的一种胃肠疾病，发病原因有病原性感染和营养因素等。大多数犊牛腹泻主要发生于犊牛出生后2周内，但在环境条件较差时，3～4周龄也仍然具有较高的易感性。在传染性因素中，大肠杆菌是引起犊牛腹泻的一种主要致病菌。临床表现为腹泻、脱水，严重者因机体脱水、酸中毒死亡。大肠杆菌的发病率和死亡率，因饲养管理水平、环境卫生的不同，具有较大的差异[1-2]。犊牛腹泻一般在气温骤降及阴雨连绵的时期多发，任何降低犊牛抵抗力的因素都会导致本病的发生[3]。近年来，随着我国养牛业集约化程度的提高，犊牛大肠杆菌病的发病率日趋增加，给养牛业带来了巨大的威胁。

2019年2月份，内蒙古某奶牛场饲养的犊牛发生腹泻，引起大量的死亡，根据流行病学和临床症状怀疑为大肠杆菌，用庆大霉素、氟苯尼考和恩诺沙星等药物后治疗无效。为了进一步确诊病因，采集发病死亡犊牛的肺、肝、肾、脾、淋巴、小肠等到河北北方学院进行了实验室诊断，为临床合理防控提供理论依据。

1 材料

1.1 病料来源 内蒙古某规模养殖场饲养奶牛约900余头，采用集中发情和配种方式繁殖。2018年11月至2019年1月，在其1号和3号养殖棚内出生犊牛陆续发生腹泻，用氨苄西林钠与庆大霉素、氟苯尼考及恩诺沙星等进行治疗，有效控制了此次犊牛腹泻。然而，2019年2月初，该场2号棚陆续出生250余头犊牛，出生不久后，部分犊牛出现腹泻症状，粪便逐渐变成粥状，内含未消化的乳凝块和血液，逐渐消瘦、虚弱、走路摇摆;至来校诊断时约有50%的犊牛发生腹泻，病死率20%。剖检变化主要在小肠，表现为小肠充盈、内有液狀内容物和灰白色的乳凝块;肠黏膜变薄，有的严重出血，呈暗红色;肠系膜淋巴结肿胀、出血。发病死亡犊牛的肺、肝、肾、脾、淋巴、小肠送检，低温保存，当日检查。

1.2 试剂与仪器 麦康凯培养基、肉汤培养基、营养琼脂、革兰氏染色液均购自北京奥博星生物技术有限责任公司;生化反应检测管、药敏纸片均购自杭州天和微生物制剂有限公司。超净台购自苏净集团苏州安泰空气技术有限公司;显微镜购自Olympus;电热恒温培养箱购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 实验动物 6～8周龄SPF级BALB/c小鼠24只，由北京实验动物中心提供。

2 方法

2.1 细菌的分离鉴定 将病料无菌操作、钓菌划线接种于麦康凯培养基、营养琼脂平板和肉汤培养基，置于37℃恒温箱中24h过夜培养。挑取单个典型疑似菌落进行革兰氏染色、镜检。

2.2 细菌生化鉴定 将纯化后的单个菌落接种于生化试验管中37℃培养24h后，观察并记录结果。

2.3 动物致病性试验 24只SPF小白鼠随机分成2组，试验组为20只，对照组为4只。试验组的小鼠腹腔接种肉汤培养物，每只0.1mL，对照组用等量的灭菌普通肉汤进行腹腔注射。48h内观察小鼠的精神状态和记录死亡情况。

2.4 药敏试验 将分离到的菌落均匀地涂抹到营养琼脂培养基上，用灭菌镊子贴上药敏片后，置于37℃恒温培养箱24h后测量抑菌圈直径的大小。结果判定参照NCCLS（2009）的[4]。

3 结果与分析

3.1 细菌的分离鉴定 从病料中共分离出4株细菌，分别编号为S1～S4。S1～S3在麦康凯培养基上长出粉红色、圆形凸起、表面湿润、边缘整齐的菌落，镜检为革兰氏阴性短杆菌;S4在营养琼脂上长出整体黄绿色的菌落，镜检为两端钝圆、长短不一的革兰阴性短杆菌。

3.2 细菌生化鉴定结果 生化试验结果显示，S1～S3分离菌符合大肠杆菌的生化特性（表1）。S4分离菌符合绿脓杆菌的生化特性（表2）。

3.3 动物致病性试验 观察接种肉汤培养物的小鼠，接种S1、S2、S3、S4以及S1～S4混合菌液肉汤培养物的小鼠，4只/组。接种S1肉汤培养物的4只小鼠在24h内均死亡;S2和S3接种小鼠24h内死亡2只，24～48h死亡2只;S4接种小鼠48h内4只全部死亡;S1～S4混合菌液24h内4只全部死亡。死亡小白鼠在接种12h后可见精神萎靡，腹泻、被毛蓬松等症状。无菌条件下采取小鼠的肝脏进行细菌分离培养，鉴定结果与分离菌相同。

3.4 药敏试验结果 药敏试验结果（见表3），分离大肠杆菌对阿米卡星、头孢吡肟、头孢哌酮敏感，对诺氟沙星、庆大霉素、氨苄西林钠、复方新诺明、新霉素、妥布霉素、环丙沙星耐药;绿脓杆菌对阿米卡星、庆大霉素、诺氟沙星、头孢吡肟、头孢哌酮、妥布霉素敏感，对复方新诺明、新霉素、妥布霉素、环丙沙星耐药。

4 讨论

经细菌的分离鉴定，从送检的3份病料中均分离出了大肠杆菌，从其中的1份病料的肺脏中分离出了绿脓杆菌。结合流行病学和临床症状、小鼠的致病性试验以及送检前后的临床治疗用药情况，判定引起该场犊牛腹泻死亡的主要原因为大肠杆菌感染。尽管1例犊牛肺部分离到绿脓杆菌且其具有较强的致病作用（导致实验感染小鼠死亡），但是实验室药敏试验确定为敏感的药物如庆大霉素、诺氟沙星以及氨苄西林等在临床治疗时均未能减少犊牛死亡，因此，绿脓杆菌可能只是部分犊牛在机体抵抗力下降的情况下继发感染的因素。绿脓杆菌主要引起水貂的出血性肺炎、或是在畜禽继发感染[5-6]。但由绿脓杆菌引起的犊牛腹泻不容忽视，1985年彭德勋报道过由绿脓杆菌引起犊牛腹泻的诊断和治疗[7]。因此，绿脓杆菌是否是导致本次犊牛腹泻的致病菌还需进一步研究。

腹泻在犊牛中的发病率极高，导致犊牛腹泻的原因有很多，主要的病原体有大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、轮状病毒等[8]。在治疗疾病的过程中，虽然抗生素起到了重要作用，但在长期使用过程中抗生素易产生耐药性。在本次犊牛腹泻的病例中，由于没有及时进行实验室诊断，盲目使用多种药物，造成了犊牛大量死亡。根据实验室诊断结果，采用阿米卡星配合头孢哌酮有效控制住了本病，不再有新的病例发生。因此，临床治疗本病时，建议先进行药敏试验，筛选出敏感药物后再进行治疗。为防止犊牛发生脱水，应及时补充5%葡萄糖生理盐水，并在其中添加碳酸氢钠，避免腹泻引起的酸中毒。为保护胃肠道黏膜，可口服鞣酸蛋白或次硝酸铋。经过3～5d治疗，即可有效控制犊牛死亡及新病例的出现。

大肠杆菌是一种条件性致病菌，只有在自身抵抗力弱时才会发病。这次犊牛严重腹泻发生时，该地区出现降雪，加之坝上地区气候寒冷，同时牛场環境相对较差，应激及饲养管理差是导致此次犊牛腹泻的主要原因，因此，加强饲养管理是防治本病的重要措施。为了避免犊牛发生腹泻，犊牛出生后应尽早吃食初乳，增强自身的抗病能力;避免犊牛受潮、受寒、饮用不洁的水;母牛妊娠期间给予丰富的蛋白质和维生素饲料，保持适当的运动;做好接产工作，母牛分娩前后彻底清洗消毒;在大肠杆菌常发的地区，可以根据血清型制备油乳剂灭活疫苗，从而进行犊牛的免疫预防。只有采取综合的防控措施，才能避免犊牛腹泻的发生，提高养殖效益。

参考文献

[1]荔霞，王胜义，刘永明，等.犊牛腹泻病因及其药物防治研究进展[J].中国畜牧医，2010，37（10）：161-165.

[2]尚婷婷. 犊牛大肠杆菌病病原的分离鉴定及其诊治[D].杨凌：西北农林科技大学，2014.

[3]刘永彬.犊牛大肠杆菌病的病因和治疗[J].今日畜牧兽医，2017（05）：25.

[4]陈虹豆.2株致犊牛腹泻大肠杆菌的分离鉴定和药敏试验[J/OL].畜牧与饲料科学，2019（02）：108-112

[5]朱利霞，王洪彬，杨楠，等.水貂绿脓杆菌病研究概述[J].黑龙江畜牧兽医，2018（18）：214-217.

[6]翟晶晶，王珊，尹姣姣，等.两株禽绿脓杆菌的分离鉴定与致病性研究[J].山西农业大学学报（自然科学版），2019，39（01）：107-112.

[7]彭德勋.犊牛绿脓杆菌腹泻的诊断和防治报告[J].中国兽医志，1989（08）：12-23.

[8]赫鸣睿.某牛场犊牛大肠杆菌病的实验室诊断与药敏试验[J].现代畜牧兽医，2019（01）：39-43.

（责编：张宏民）