SIRT6在喉鳞状细胞癌组织中的表达及其临床意义*

张竹萍 杨景朴 赵胤 程金章 李松 赵畅 王宗贵

喉癌是当今社会常见的恶性肿瘤之一，占头颈肿瘤的30%～50%[1]。在我国东北地区由于吸烟、酗酒等不良生活习惯，喉癌的发病率较高。目前喉癌的主要治疗手段为手术治疗结合放疗及化疗的综合治疗。但对于中晚期喉癌疗效仍不满意，并且严重影响患者生活质量。因此，寻求更加有效的诊断和治疗方法是医疗科研工作的重要研究方向。有研究[2，3]显示,沉默信息调节因子 6（Sirtuin6,SIRT6）蛋白可能通过DNA修复、调节基因转录、控制代谢等作用机制抑制肿瘤细胞的发生与发展,是目前备受关注的潜在抗癌蛋白之一。然而关于SIRT6蛋白是否参与喉癌的临床进展,以及SIRT6蛋白表达与喉癌各临床参数的关联性的研究尚未见报道。本研究采用免疫组化方法检测喉癌中SIRT6的表达水平,并分析SIRT6蛋白表达与主要临床参数和预后的关系，为进一步研究SIRT6对喉癌的具体作用机制和临床应用提供依据。

资料与方法

1 临床资料

收集选取2009年1月～2012年1月就诊于吉林大学第二医院并接受手术的喉癌手术标本50例，病理证实均为喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）。手术前均未行放疗、化疗及肿瘤其他相关治疗。其中男40例，女10例；年龄44～79岁，平均59.8岁；发生部位：声门型32例，声门上型18例；2002年AJCC喉癌分期Ⅰ～Ⅱ期26例，Ⅲ～Ⅳ期24例；有淋巴结转移22例，无淋巴结转移28例；病理学分级：高分化22例，中分化22例，低分化6例。另取同期行手术治疗的声带息肉病变标本16例作为对照。其中男9例，女7例；年龄45～60岁，平均55.8岁。

2 免疫组化法

所有标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，4μm厚连续切片，脱蜡，抗原修复等步骤，IHC采用SP法。兔抗人SIRT6多克隆抗体(ab118487，美国Abcam公司)按1∶100稀释，二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（31460，美国invitrogen公司）按1∶2000稀释，DAB 染色试剂盒（P0203，碧云天）按照说明书进行操作。每批实验均设有阴性及阳性对照。

3 SIRT6表达量的评估

SIRT6根据染色强度,结果判读参照Remmele and Stegner[4]的评分方法如下:肿瘤细胞根据视野中着色的细胞数百分比分为0～4分，根据染色深度分为0～3分。此外，计算组织化学评分（histochemistry score,H-score）是由阳性肿瘤细胞所占整个肿瘤细胞的百分比评分乘以染色强度评分计算,分值范围为0～12。每张切片随机选取5个高倍镜视野，取平均值。评分0～3为低表达;评分3～12为高表达。

4 治疗方法及随访

50例均采用以手术为主的综合治疗。患者从手术之日起开始随访，随访截止日期2017年4月。随访方式采用门诊随访或电话随访。无进展生存率为从患者手术开始到随访截止无疾病进展患者占全部患者的比例。

5 统计学方法

采用SPSS l8．0进行统计学分析。本研究中定量资料采用方差分析,计数资料采用卡方检验。生存率计算采用Kaplan-Meier法，差异用log-rank法进行检验。P＜0．05为差异有统计学意义。

结果

1 SIRT6在喉癌组织中的表达

免疫组化结果显示，SIRT6蛋白主要表达于细胞胞质中，也有部分可在胞核中表达，其特点为棕黄色颗粒。喉癌组SIRT6的相对表达量为3.33±1.148，对照组为5.37±1.043，两组比较差异有统计学意义(t=-6.326，P＜0.001)，见图 1。

图1 免疫组化法检测SIRT6在喉癌组织与声带息肉组织中的表达

2 喉癌组织中SIRT6的表达与临床特征的关系

SIRT6蛋白在不同的分化程度、临床分期及有无淋巴结转移的喉癌组织中呈差异表达。不同分化程度的喉癌组织中SIRT6表达有统计学差异，SIRT6在高分化喉癌组织中表达率较高，中、低分化喉癌组织中表达率低（χ2=20.576，P＜0.001）。根据临床分期比较，晚期喉癌SIRT6的表达率低于早期喉癌组织, 差异均有统计学意义（χ2=13.675，P＜0.05)。SIRT6表达率与有无淋巴结转移差异无统计学意义（χ2=0.216，P=0.642）。而在不同性别、年龄、发生部位则差异无统计学意义。见表1。

表1 SIRT6表达与患者的临床病理参数相关性

3 SIRT6表达水平与喉癌患者预后的关系

到随访截止日，本次研究仅1例患者(SIRT6低表达患者)失访，总随访率为98.00%。30例SIRT6高表达患者，无进展生存率为66.70%，19例SIRT6低表达患者，无进展生存率为42.10%，两组差异有统计学意义(χ2=3.983，P=0.046)，见图 2。

图2 SIRT6的表达与喉癌患者无进展生存率的关系

讨论

沉默配型信息调节蛋白（silent mating type information regulation 2 homolog,sirtuin）是一类属于Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶的高度保守的蛋白家族[5，6]。哺乳动物中存在7种同源蛋白，即SIRT1～SIRT7。Mostoslavsky等[7]通过建立SIRT家族基因敲除小鼠，发现只有SIRT6基因敲除的小鼠表现出典型的早衰症状，因而SIRT6在抗衰老领域引起了广泛的关注。随后的机制研究揭示SIRT6对于维持基因组和端粒的稳定、调控炎症反应、调节糖和脂类代谢方面都发挥重要作用，从而影响机体的寿命调控[8]。由于肿瘤也具有基因组不稳定、不可控细胞增殖和通过无氧呼吸提供能量 (Warburg效应)等共性，而SITR6参与维持基因组稳定、调节糖代谢的调控，说明SIRT6可能不仅是个重要的寿命调控蛋白，还可能对肿瘤具有调控作用。

相关研究显示，SIRT6基因表达的变化参与了人类多种肿瘤的发生发展。SIRT6作为潜在的抑癌基因，在前列腺癌，乳腺癌，非小细胞肺癌中表达下调[9-11]。Vanmeter等[12]证明SIRT6过表达可通过其单ADP核糖基转移酶活性杀伤纤维肉瘤细胞系和人宫颈癌细胞系，但对正常细胞无影响。Lin等[3]亦验证在人结肠癌中，SIRT6蛋白表达水平显著降低，同时降低的还有泛素特异肽10；该研究认为USP10可通过抑制SIRT6泛素化以保护其不被蛋白酶体降解；USP10通过SIRT6拮抗c-Myc的转录活性以抑制肿瘤生成。但是Ming等[13]认为在上皮中，SIRT6扮演癌基因的角色,发现紫外线暴露可增加SIRT6表达，SIRT6可通过抑制腺苷酸活化蛋白激酶途径促进环氧化酶2（Cox-2）的表达，进而促进细胞增殖和细胞在皮肤表皮层的存活；小鼠皮肤特异性敲除SIRT6可抑制成瘤。

本实验通过免疫组化法检测了SIRT6蛋白在喉癌组织中的表达,结果显示SIRT6在喉癌组织中的表达水平显著低于声带息肉等正常组织，表明SIRT6在喉癌中扮演抑癌基因的角色，参与了喉癌的发生发展。进一步对SIRT6蛋白表达与临床参数的相关性分析显示，SIRT6的表达与喉癌的分化程度、临床分期相关。低分化喉癌组织中阳性表达率也低，临床分期Ⅲ/Ⅳ期的晚期喉癌组织中SIRT6的阳性表达率低于早期喉癌。推测SIRT6参与了喉癌的发生发展过程,随着喉癌的发展，SIRT6的表达水平呈现出了递减的趋势,验证了SIRT6表达的缺失可能促进了肿瘤的发展。但分析发现SIRT6的表达与淋巴结转移与否无统计学差异，表明SIRT6与喉癌的侵袭、转移关系不大。Lai Cc等[14]研究SIRT7在头颈部鳞状细胞癌中的表达情况，结果显示，SIRT1,SIRT2，SIRT3，SIRT5，SIRT6 和 SIRT7 在头颈部鳞状细胞癌组织中表达水平低于癌旁正常组织，与本研究的结果一致。

基于此,本研究结果表明LSCC组织中SIRT6蛋白表达水平可能与LSCC临床病理特征相关，SIRT6的表达与喉癌患者预后的关系分析发现，SIRT6高表达患者的无进展生存率显著高于SIRT6低表达患者的无进展生存率，提示SIRT6的表达可能与喉癌预后有关。SIRT6有望作为一种新的潜在的肿瘤生物标记物，拓展我们对肿瘤本质的认识，并为相关疾病治疗提供新思路。但考虑到受纳入病例数量的限制，已有的研究结果仅揭示了冰山一角，许多问题尚不清楚。尚需积累大样本高质量研究进一步证实。