肝癌局部微创治疗的现状与进展

玉苏甫卡迪尔·麦麦提尼加提　吐尔干艾力·阿吉　邵英梅　陈新华　温浩

【摘要】 近年来，肿瘤发病在全球范围内持续增加，肿瘤病死率逐渐上升，据统计，在各种恶性肿瘤中原发性肝癌居发病率第四位及肿瘤致死病因第三位。目前肝癌的治療方法仍是以手术切除为首选，但是因该病早期症状隐匿，大部分患者在发现病变时已属中晚期，已失去手术切除的机会。故寻找一种安全、有效的肝癌治疗手段已刻不容缓，近年来众多专家探索肝癌的新治疗方法，并取得了显著的进步。本文对目前肝癌的局部微创治疗的最新前沿进展和临床应用现状及进行综述。

【关键词】 肝癌; 微创消融; 纳秒脉冲

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.10.085 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2019）10-0-05

由于人口老龄化、人口增长和环境污染等原因，肿瘤发病在全球范围内持续增加。我国是人口大国，也是癌症大国，根据GLOBOCAN的最新统计报告显示，2018年全世界范围内肿瘤新发病例约1 810万例，我国新发癌症病例是380.4万例，占全世界的1/4[1]。2018年2月国家癌症中心发布的“中国癌症报告2018”显示：与上一期报告相比，中国癌症新发人数继续上升，从368万例增加到380.4万例，增幅3.2%，在各种恶性肿瘤中原发性肝癌（primary carcinoma of liver，PCL）居发病率第四位及肿瘤致死病因第三位[2]。2017年版国家卫计委原发性肝癌诊疗规范指出肝细胞癌（hepatocellular carcinoma ，HCC）是我国最常见的原发性肝癌，占85%～90%以上[3]。目前在临床上肝癌的治疗方法主要有手术切除、药物治疗、放射治疗、免疫治疗、介入栓塞治疗及局部微创消融治疗等。

目前肝癌的治疗方法仍是以手术切除为首选，但是因该病早期症状隐匿，大部分患者在发现病变时已属中晚期。又因肝癌的多中心起源和异质性，肿瘤临近大血管、合并乙肝肝硬化，导致肝脏储备功能差，致使根治性手术切除难度及术后复发率高。据统计，肝癌只有25%左右的患者存在外科手术切除的机会[4]，故寻找一种安全、有效的肝癌治疗手段已刻不容缓，近年来众多专家探索肝癌（尤其是中晚期肝癌）的新治疗方法，并取得了显著的进步。本文旨在对目前肝癌的局部微创治疗的最新前沿进展和临床应用现状综述如下。

1 射频消融术（radio frequency ablation，RFA）

RFA治疗肝脏肿瘤最早是1993年由意大利的Rossi等[5]在1996年率先应用于临床，1999年6月第三军医大学西南医院在国内率先开展了肝脏肿瘤的射频消融治疗，随后国内多家医院相继开展该项治疗。射频消融治疗肝癌以其微创、安全、疗效确切而得到医患双方的认可，并在国内外广泛开展，目前已成为继手术切除、介入治疗后的第三大肝癌治疗手段[6]。

1.1 射频消融术的基本原理及适应证

射频是一种电磁波，其频率在104～1 012 Hz，其作用机制是：在影像技术引导下将射频电极穿刺至目标肿瘤组织内，发射375 ～500 Hz的高频交变电流，激发肿瘤内离子产生高频震荡，互相摩擦而产生热量，使消融区局部温度升高，破坏细胞膜及骨架结构 ，使肿瘤和消融区组织产生凝固性坏死。射频消融的热损伤一般开始于42 ℃，50 ℃是射频消融杀死肿瘤所需的最低温度阈值[7]。此外，肝硬化合并的肝癌可以为射频消融治疗提供更好的条件，肿瘤周围的硬化组织能有效地防止热量的扩散，从而增强热效应并能减少周围正常组织的损伤，这种现象被称为“烤箱反应”[8]。

2017年中国抗癌协会肝癌专业委员会（CSLC）发布的《肝癌射频消融治疗规范的专家共识》指出肝癌射频消融的适应证：（1）单发肿瘤，最大直径≤5 cm;（2）肿瘤数目≤3个，最大直径≤3 cm;（3）没有脉管癌栓、邻近器官侵犯;（4）肝功能分级Child-Pugh A或B，或经内科治疗达到该标准者;（5）不能手术切除的直径≥5 cm的单发肿瘤或最大直径≥3 cm的多发肿瘤，射频消融术可以作为姑息性治疗或联合治疗的一部分[9]。

1.2 射频消融术的疗效及安全性评价

Camma等[10]通过COX回归分析研究202名射频消融治疗后的HCC患者，结果证实：治疗后12、24、30个月总生存率分别为80%、67%、57%、总复发率分别为22%、38%、44%;治疗后并发症发生率为3.9%。还有报道证实，对于肿瘤直径为3～5 cm和大于5 cm的肝癌进行单次射频消融治疗后，癌灶残留率分别为17.5%～38.7%、50%～76.1%[11]。可见，射频消融治疗肝癌时消融不彻底会造成癌灶残留。通过研究发现，射频消融处理后靶部位的炎症能够促进残余肿瘤复发的进展。由于残留肿瘤的存在和射频消融诱导的炎症，射频消融治疗肝癌的有效性大大降低，最近他们还发现，阿司匹林能够抑制射频消融后VX2兔子模型的炎症反应而提高射频消融的有效性，并提出阿司匹林可作为肝癌射频消融治疗的辅助治疗，这个结果能够为提高射频消融疗效提供良好的理论基础[12]。

加拿大癌症治疗中心（cancer care ontario，CCO）提出恶性肿瘤的诊断到治疗的等待时间窗应小于28 d，虽然HCC是一种生长比较快的恶性肿瘤，但目前没有有关HCC等待时间窗的指南，最近Brahmania等[13]通过研究证实射频消融治疗HCC时，等待时间超过30 d的患者肿瘤残留风险增加9%，死亡率增加23%;这表明在临床工作中应该更加重视HCC的早期发现，早期诊断和早期治疗;最近Hu等[14]通过回顾性临床研究证实：肝癌合并脾功能亢进患者通过腹腔镜下脾切除+射频消融治疗后患者1年生存率为78.8%，这一结果与同期开放肝切除+脾切除术的效果相当，并有患者术后恢复快、经济负担轻等优势。

射频消融术具有微创、安全、经济、恢复快等优势，同时还有残留率和复发率高、热损伤、局部炎症反应等问题存在;因此需要加强消融电极精准设计，继续扩大消融范围，避免热损伤，减少热沉效应。

2 纳秒脉冲电场消融术（nano second pulse electric field，NSPEF）

纳秒是1/10亿秒，纳秒脉冲电场是指脉宽只有几个到几百个纳秒的电脉冲形成的电场，纳秒脉冲电场消融技术是生物电磁学、高电压及微电子学等领域的前沿交叉新技术。近年来，脉冲电场（PEF）对细胞结构和功能的影响与对生物体的治疗作用逐渐成为生物电领域的研究热点，纳秒脉冲电场从军事应用进入生物医学，作为一种微创，有效的癌症治疗方法，最近开始得到了广泛研究并应用于癌症的电化学治疗、药物投送等领域而展示了良好的应用前景。

2.1 纳秒脉冲电场消融术的基本原理及穿膜效应

纳秒脉冲消融治疗肿瘤作为新发展起来的领域，其在细胞内的生物过程和分子机制目前仍未很清楚，纳秒脉冲引起的细胞膜反应是目前的研究热点，各研究小组根据不同的脉冲设备和膜孔标记方法提出的不同学术观点：例如美国弗兰克瑞迪电磁研究中心的Pakhomov等[15]发现，纳秒脉冲的次数只能增大电穿孔的数量，但不增加其大小。还有些研究提出，由于纳秒脉冲的持续时间短于细胞外膜的充电时间，可在细胞膜完全充电之前穿入细胞内而作用于细胞亚结构，引起内质网的损伤、线粒体膜电位差的改变，进一步还可以破坏细胞微丝骨架导致细胞形态的变化而导致肿瘤细胞的凋亡，并不会引起细胞膜的电穿孔现象[16]。纳秒脉冲电场对细胞膜产生的物理影响，是该技术各种生物医学应用的物质和功能基础。关于纳秒脉冲消融后肿瘤细胞的转归，有学者提出，纳秒脉冲治疗后发生肿瘤细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻、产生活性氧[17-19]，同时Caspase3被激活[20-21]，这说明肿瘤细胞发生了凋亡。最近一些研究发现，纳秒脉冲电场处理后部分肿瘤细胞膜的完整性受到损害，导致水的吸收增加，发生肿胀，最终细胞膜破裂而坏死，此现象表明纳秒脉冲电场后并不是所有的细胞都会发生凋亡，其中一部分细胞可能会转向坏死。Pakhomova等[22]报道，纳秒脉冲电场处理后细胞的坏死大多数发生在处理1～2 h后，并提出：两种细胞死亡模式之间可以通过激活或阻止细胞肿胀来控制。说明纳秒脉冲杀伤肿瘤存在多种不同死亡机制，其剂量效应及分子机制根据不同肿瘤细胞类型而各有不同。

目前美国的Muratori等[23]研究纳秒脉冲电场的细胞膜穿孔机制时发现：纳秒脉冲消融能够激活Tmem16-F蛋白，Tmem16-F是相似于Ca2+依赖性磷脂翻转酶和Ca2+依赖性氯离子通道的一种蛋白质。Tmem16-F的激活能在短時间内将细胞内Ca2+下降，而能够影响纳秒脉冲电场诱导的细胞皱缩。实验证明，纳秒脉冲消融后，Tmem16-F过度表达的细胞的存活率比对照组下降34%;这表明Tmem16-F能够增强纳秒脉冲消融对肿瘤细胞的效应。Jensen等[24]发现，纳秒脉冲电场对哺乳动物细胞的电穿孔可提高该细胞对纳秒脉冲电场的敏感性，而有利于他们的下一个脉冲电场处理，这种现象叫“电敏化”现象，其实验表明第2次脉冲消融治疗效果是第1次的2.5～6倍;通过敏化作用能够降低治疗需要的剂量而不降低其效果，这种现象可以用来减少纳秒脉冲消融的痉挛，心颤等副作用。Pakhomova等[25]还提出通过电敏化可以促进静脉药物的吸收，他们发现单一100 μs的电脉冲处理后血清中博来霉素的浓度增加了10倍。这对以后的临床治疗疗效起很重要的作用。

2.2 纳秒脉冲消融术的免疫学特点

纳秒脉冲消融作为电化学疗法治疗肿瘤的新发现，近几年来引起了不少专家的兴趣，科学家们通过大量体内及体外实验研究总结出了纳秒脉冲电场消融的以下特点。

2.2.1 诱导细胞凋亡 目前国内、外的相关研究已证实纳秒脉冲消融通过内源性及外源性凋亡途径导致肿瘤细胞的凋亡而能够避免其他致癌突变和全身的副作用，内源性凋亡途径包括增加活性氧的产生：活性氧作为一种凋亡因子，通过断裂DNA双链、破坏BCL-2蛋白的平衡而增加线粒体的通透性以及促进凋亡小体的形成等方法诱导凋亡[26-27]。外源性凋亡途径主要通过激活Caspase3基因而诱导肿瘤细胞的凋亡[28];此外，Pakhomova等[29]的课题组最近报道纳秒脉冲电场消融后部分细胞会转向坏死，但其机制尚未清楚。

2.2.2 抑制新血管的形成 研究表明纳秒脉冲电场能够阻断血管生成因子VEGF、PD-ECGF等的增生而阻断血管的形成;此外，陈新华等[30]通过优化脉冲电场（强度4 MV/m、脉宽100 ns、脉冲频率0.5 Hz）处理大鼠肝脏后发现电场作用范围内的血管出现凝血栓塞及炎性细胞的集聚现象，表明脉冲电场能够使肿瘤血管缺血坏死;抗血管新生不仅能阻断肿瘤的血供而使肿瘤坏死，还能够有效避免肿瘤的转移和复发。此项特征能够使纳秒脉冲电场在肿瘤治疗方面得到优势并能够提高疗效。

2.2.3 纳秒脉冲电场对肿瘤的选择性 有关研究已证实，肿瘤细胞对纳秒脉冲的反应比正常细胞更强[31]，这意味着纳秒脉冲电场对肿瘤细胞有选择性，这个特点能够明显降低脉冲电场对肿瘤周围正常组织的损伤而提高其安全性。

2.2.4 起效快，无热损伤 在细胞实验上，纳秒脉冲处理后30～45 min就能观察到Caspase酶的激活[32]。此外，脉冲电场处理后供血血管的阻断也是迅速的[33]。纳秒脉冲在很短时间内释放极大的能量，不会引起明显的温度变化，可以保护肿瘤周围的神经、血管等热敏组织，而且能够减少纤维结缔组织坏死而使瘢痕最小化[34]。

2.2.5 抗肿瘤、免疫激发作用 肿瘤患者本身处于相对免疫抑制状态，纳秒脉冲处理后磷脂丝氨酸的外翻可以激活机体抗原提呈活性，并其释放出的HMGB-1蛋白是树突状细胞发生迁移的必要条件[35]，Nuccitelli等[36]通过小鼠的体内实验观察到纳秒脉冲电场可以激发肿瘤细胞的特异性免疫反应，并指出纳秒脉冲电场消融后激发的免疫反应比手术切除激发的反应可以更加明显的抑制第2个肿瘤的定植和生长，这一免疫反应可能通过CD4+ T细胞的积聚来实现。此外，脉冲电场消融后许多自体固有的肿瘤抗原仍然保留，进而触发抗肿瘤的适应性免疫反应，成为治疗性免疫。Chen等[37]使用肝细胞癌模型研究纳秒脉冲的免疫反应时发现：纳秒脉冲消融过的大鼠再次注射N1-S1细胞后肿瘤不能再生长，表明纳秒脉冲电场可以起保护性防御作用。脉冲电场作为既可以微创消融肿瘤，又能激发机体特异性免疫反应的新型肿瘤治疗手段则具备更强的临床应用潜力。

2.3 纳秒脉冲消融研究的应用

最近几年的时间里，关于纳秒脉冲电场的作用，医学和生物工程领域的众多科学家开展了大量的动物模型实验和体外细胞实验并取得了不少的进展，最早2010年Chen等[38]用纳秒脉冲处理小鼠的皮下黑色素肿瘤，并成功消除了黑色素瘤，这为了纳秒脉冲在临床中的应用奠定了基础。随后Nuccitelli等[39]研究了纳秒脉冲对基底细胞癌的效应，发现脉冲处理4周以后肿瘤体积减小了99.8%，这表明纳秒脉冲消融对基底细胞癌有一定的疗效，Yin等[40]通过体内、外实验证实纳秒脉冲消融对皮肤鳞状细胞癌有明确的治疗潜力。2011年，Stephen等[41]在体外通过纳秒脉冲处理小鼠，大鼠和人的HCC细胞后发现纳秒脉冲能够有效治疗肝细胞癌并证实了纳秒脉冲消融肝癌的部分机制。还有不少研究证据表明纳秒脉冲消融对胰腺癌[42]、卵巢癌[43]、口腔癌[44]等肿瘤有效。最近，有学者通过绵羊体内实验证实，纳秒脉冲消融对肝囊性包虫病有一定的治疗效果，他们纳秒脉冲处理自然感染肝囊型包虫病的绵羊后通过超声实时监测时发现包虫囊肿多在术后第3天开始出现内囊塌陷，随时间的推移，包虫囊肿内的无回声区减少，低回声区增多，囊肿向坏死实变的方向演变[45]。这一发现挖出了纳秒脉冲消融在治疗寄生虫病方面的潜力并为此后临床上寄生虫病的局部治疗提供了理论基础。

納秒脉冲消融术在美国已经完成了基底细胞癌的临床前期试验（登记号ID：NCT01463709），这意味着纳秒脉冲电场技术将逐渐会进入了临床工作。纳秒脉冲消融对细胞的作用机制是多方面、多层次的，是细胞内外一系列的物理、生化综合因素相互作用的结果。随着基础研究的逐渐深入，临床应用的实践应用，纳秒脉冲会成为具有临床应用前景的肿瘤微创消融手段。

3 肝动脉介入栓塞术（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）

肝癌的介入治疗是介于外科与内科治疗之间的局部微创治疗方法，2015年美国国立综合癌症网（NCNN）发布的肝癌治疗指南认为介入栓塞治疗是中晚期肝癌的首先治疗方案[46]，2017年版国家卫计委原发性肝癌诊疗规范中指出：介入治疗目前被公认为肝癌非手术治疗的最常用方法。它包括血管内介入和非血管介入治疗，在肝癌治疗中血管内介入治疗占绝大部分。目前临床上比较常用的介入方法有选择性肝动脉灌注治疗法（TAI）、选择性肝动脉栓塞（TAE）疗法及肝动脉化疗栓塞法。基本原理就是在皮肤穿刺大约3～5 mm的小口，从动脉（主要是股动脉）内插管至肝癌供血动脉（95%的血供来自肝动脉），再通过导管给药或者进行栓塞。

2017年我国卫生部制定的HCC诊疗规范中明确TACE适应证包括：（1）肝癌分期Ⅱb、Ⅲa、Ⅲb期的部分患者及外科切除术后和肝移植术后复发患者;（2）肝功能Child-Paugh A或B级并ECOG评分0～2分的患者;（3）不能或不愿意手术的Ⅰb期和Ⅱa期患者;（4）多发结节型肝癌患者[47]。但是国际上比较公认的是肝癌巴塞罗那分期（BCLC分期）B期（中期）并不伴有门静脉、下腔静脉等血管侵犯和淋巴结转移，远处转移的患者的标准治疗方案。介入栓塞疗法对肿瘤的治疗不仅有操作简单易行，安全可靠，疗效确切等优势，还能够有效减轻疼痛，年老体弱者不需全麻，可以重复进行而且治疗费用相对比较低。与此同时，介入栓塞疗法的最大缺点是部分肿瘤可多血管供血，这样的情况下介入治疗后肿瘤残留细胞还能够存活下来，复发率较高。而且肝肾功能不全、有凝血功能障碍的患者禁忌使用介入栓塞治疗。

4 结语

目前除了上述三种肝癌微创治疗方法以外，还有肝癌无水酒精注射（PEI）、微波消融治疗（MWA）等方法也得到了相关机构和专家们的重视并已在临床上应用。肝癌的局部微创治疗方法以它的安全，有效，微创，经济，术后恢复快，并发症少等优势得到了临床广泛应用，与此同时，微创治疗常常受到肿瘤的大小、位置及数目等因素的限制，并且单一一种微创消融治疗的疗效远远不及联合治疗的效果，文献[48]通过研究表明，与单纯射频消融疗法相比，射频消融加TACE疗法更能提高患者的生存率;可见，探索各种新型微创治疗方法，制定联合序贯综合治疗方案，能够提高晚期肝癌的临床疗效。

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