文山三七外植体灭菌处理培养研究

单昌蓉 朱金霞 陈丽华

摘要    本试验以文山三七的成熟种子为试验材料，用不同浓度的升汞溶液对其进行不同时长的灭菌处理，观察和筛选适宜的升汞浓度和适宜的灭菌处理时间。结果表明，用0.01%升汞溶液对带种皮种子或去种皮种子进行灭菌处理时，适宜的处理时间均为30 min，处理的种子外植体的污染率不高，且能保障不污染种子有一定的发芽率;用高浓度的升汞溶液处理去种皮的三七種子，对种子的伤害较严重，致使不污染的种子发芽率较低。

关键词    三七;种子;组织培养;外植体

中图分类号    S567.239        文献标识码    A        文章编号   1007-5739（2019）01-0066-02

三七（Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen）与人参同属五加科人参属植物，为我国特产名贵中药材，有止血、补血、治疗跌打损伤的作用。有研究表明，三七主要以块根入药，其块根中的主要成分为三七总皂甙、三七素、三七黄酮、三七多糖等，具有改善心脑血管疾病、降血糖、降血脂、降血压、抗血栓、抗衰老、抗休克、抗炎症、镇痛、镇静、增强免疫力等作用[1-2]。我国的这一传统珍贵药材三七，因95%左右三七产自云南省文山州，故又称文山三七。

云南文山三七种植产业中，因传统种植优质种苗缺乏，导致病虫害严重，种植困难，产量低。随着科技的进步，有学者尝试用组织培养方法研究和生产试管优质种苗，以满足生产和市场的需要。1978年，中科院昆明植物研究所的郑光植等[3]用文山三七的茎段、块根和粗根为起始材料，对其愈伤组织的诱导进行研究，结果表明，在生长素2，4-D和椰子乳配合使用时，能有效促进茎段和粗根的愈伤组织，而块根却较难诱导出愈伤组织。1992年，陈伟荣等[4]用三七的种胚、幼苗、休眠芽、花序4种材料，通过诱导愈伤组织、胚状体、不定芽等途径，最终主要从幼嫩花序中成功诱导出逾2 000株试管苗植株，随后对试管苗植株的再分化、丛芽诱导、壮苗、生根培养等进行了系统的研究探索，为全省三七试管种苗工厂化生产研究打下了基础。2013年，孙玉琴等[5]用剥除种皮后的文山三七成熟种子，成功诱导出了根、茎、叶等生长表现良好的试管实生苗，初步建立起了文山三七实生苗组培体系。2016年，李  涛等[6]采用完全试验法或正交试验法，以文山三七块根为外植体，研究得出了文山三七块根外植体最佳表面消毒方案和最佳愈伤组织诱导、分化生芽、生根等方案。

本试验以文山三七优良品种的成熟种子为外植体，进行外植体消毒灭菌、诱导培养无菌实生苗等研究，拟以此为基础进一步进行文山三七愈伤组织或丛生芽的诱导、壮苗和生根培养等试验研究，初步建立了文山三七优良品种的无菌实生苗组培体系，以期为文山三七优质试管种苗的组织培养快速繁殖技术体系研究提供参考。

1    材料与方法

1.1    试验材料

试验材料为当年采集的文山三七优良品种的成熟种子，购买于文山壮族苗族自治州马关县文山三七生产基地。采种植株在田间生产健壮、无病且已种植3年。

1.2    试验设计

试验设3组处理，每组又设4个时间处理，分别为带种皮种子处理（A），先用清水振荡清洗2～3次，再将种子分为4组（10粒/组），分别用0.01%升汞灭菌处理25、30、35、40 min，最后用无菌水振荡清洗2～3次，每次2～3 min;种子去种皮处理（B），先用清水振荡清洗2～3次，再将种子分为4组（10粒/组）后，分别用0.01%升汞灭菌处理 25、30、35、40 min，最后用无菌水振荡清洗2～3次，每次2～3 min;种子去种皮后处理（C），先用清水振荡清洗2～3次，再将种子分为4组（10粒/组），分别用0.1%升汞灭菌处理15、20、25、30 min，最后用无菌水振荡清洗2～3次，每次2～3 min。

1.3    试验方法

1.3.1    培养基的制备。无菌种子诱发的培养基为MS+6-BA 1 mg/L+白糖30 g/L+琼脂6 g/L，pH值5.8。培养基配制好后，按每瓶50 mL分装到培养瓶中，并用耐高温塑料封口膜封口扎紧，于高压湿热灭菌锅121～125 ℃下灭菌25 min后，干燥备用。

1.3.2    外植体处理及培养。自然条件下三七种子寿命大约为15 d，种子采集后用含水分20%左右的湿沙保存，使种子度过后熟期。将种子带回实验室后，选取颗粒饱满、大小均匀的种子作为试验材料，对种子进行不同灭菌处理后，于超净工作台上接种至上述培养基中，在光照强度1 500 lx、光照时长12 h/d、温度26 ℃左右的条件下进行初步培养，诱导种子发芽。以种子污染率作为本次试验的主要考查指标，以不污染种子的发芽率作为考查辅助指标。

2    结果与分析

2.1    不同处理对文山三七不去种皮种子污染率的影响

从表1可以看出，随着0.01%升汞溶液灭菌处理时间的延长，不去种皮种子的污染率也逐渐降低，最高污染率为80%，最低污染率为20%;而不污染种子的发芽率则与0.01%升汞的处理时间成负相关，即0.01%升汞溶液灭菌处理时间越长，不污染种子的发芽率越低。在处理组A中，当0.01%升汞的灭菌处理时间为30 min时，污染率为60%，不污染种子的发芽率为50%;而其他处理时间，或者污染率太高，或者不污染种子发芽率太低。因此，在本处理组中，0.01%升汞溶液灭菌处理30 min是对文山三七不去种皮种子较适宜的灭菌处理时间。