多壁碳纳米管分散固相萃取气相色谱-质谱法测定红甜菜中10种农药残留

王喆 ，周芹，李慧敏

（1.黑龙江大学化学化工与材料学院，哈尔滨150080；2.黑龙江大学农作物研究院，哈尔滨150080；3.农业部糖料产品质量安全风险评估实验室，哈尔滨150080；4.农业部甜菜品质监督检验测试中心，哈尔滨150080）

0 引言

红甜菜亦称红菾菜、食用甜菜等，与叶用甜菜属同一变种，其根和叶可食用，根中含有丰富的天然红黄色素、酚类和抗坏血酸等活性物质，以及多种维生素、甜菜碱等多种药理成分，具有抗菌、消炎、抗肿瘤、调节免疫等功效，被世界卫生组织和美国防癌协会选为对人们日常饮食最佳的13种蔬菜之一和30种有防癌作用的果蔬之一[1-3]。

但是近年来，随着化学除草剂、杀菌剂、杀虫剂等农药在农业上的广泛应用，新农药的研发使用以及一些禁用农药的改头换面，植株中的农药残留对甜菜造成极大危害。目前甜菜上登记注册的农药23种，未注册的在用及禁用农药十几种。在甜菜上虽已进行了除草剂残留的检测研究[4-5]，但对这些农药的监控以及在植株中的残留检测国内尚未正式开展，尤其是食用甜菜[6-7]。日本、美国及欧盟都已制定出食用甜菜中农药残留的最大检出限量（MRL），在我国，虽然目前已经制定出甜菜中49种农药残留的MRL值，但是对这些农药的测定方法基本上是参考蔬菜及食品的标准，而部分农药还没有成熟的检测方法，因此，建立食用甜菜中快速、准确、灵敏的多残留检测方法迫在眉睫。

农药多残留检测最常用的方法主要有气相色谱法（GC）[8]、液相色谱法（LC）[9]、气相色谱-质谱联用的方法（GC-MS）[10]、液相色谱-质谱联用的方法（LC-MS）[11-13]。由于色谱法是依据保留时间（Retention time）定性，对于保留时间相同或者相近的物质无法定性。而且大部分色谱法只能对某一类农药残留进行检测，例如：GC-FPD（火焰光度检测器）只能用于有机磷农药检测，而GC-ECD（电子捕获检测器）只能用于有机氯农药检测等。色谱-质谱联用采用选择离子监测（SIM）或者多反应监测（MRM）模式可以解决样品成分的共流出问题。红甜菜样品基质复杂，含有大量的色素、生物碱及其他的有机无机成分，而待测的目标化合物含量往往较低，因此，样品的前处理是保证精确分析的前提，同时也保护仪器免受污染和损害[11]。目前，QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）法是普遍采用的前处理方法[11-15]，采用N-丙基乙二胺键合固相吸附剂（PSA）对样品提取液进行分散固相萃取净化，该方法具有快速、简便、成本低廉的特点，迅速成为农药残留前处理使用较为广泛及欧洲标准委员会认可的实验方法。近年来，研究者们又发展了此方法，寻找出很多前处理的吸附剂，诸如C18、石墨化炭黑（GCB）以及MgSO4等，这些吸附剂还可以组合使用，用于农药残留检测前处理的净化过程。碳纳米管（Carbon nanotubes，CNTs）是在1991年被发现的一种新型碳材料，其独特的纳米中空结构，大的比表面积使其在生物化学、物理学、环境化学及其他领域具有较为广泛的应用[11-12]。与单壁碳纳米管（Single walled carbon nanotubes，SWCNTs）相比，多壁碳纳米管（Multiwalled carbon nanotubes，MWCNTs）吸附性能力更强，比GCB、PSA、C18具有更大的比表面积、更大的吸附容量。目前已应用于水样、农药残留[12，16-18]、兽药残留的检测，但是在甜菜农药残留检测尚未见报道。本文建立了基于吸附性能好、净化效率高的多壁碳纳米管作为吸附剂的方法，结合气相色谱-质谱联用法检测了红甜菜中10种农药残留，方法操作简单、快速、准确、成本低[16]，能满足红甜菜中农药残留分析的要求。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

正己烷、丙酮、乙腈、甲苯均为色谱纯，购自迪马公司；无水硫酸镁和氯化钠均为分析纯，使用前于650℃下灼烧4 h，备用），购于天津市光复科技发展有限公司；MWCNTs（直径大于50 nm；长度为9.089µm，纯度为98%，比表面积为244 m2/g），由山东大岛纳米材料有限公司提供。农药标准品浓度均为1 000 mg/L，购于农业部环境保护科学监测所（天津）。GCB、PSA、C18购于安捷伦公司；Agilent公司气相色谱-质谱联用仪（7890A-5975C）；旋转蒸发仪RE300；KQ-250DB型数控超声波清洗器；HY-6调速多用振荡器；德国Sigma公司离心机；匀浆机（LB20ES美国Waring公司）。

1.2 材料与方法

1.2.1 混合标准溶液的制备

首先将10种农药标准品用甲苯配制成，分别吸取10种农药标准品0.1 mL，转移至10 mL容量瓶，用甲苯定容至刻度，即得到浓度为1 mg/L的混合标准储备液。准确移取一定体积的标准储备液，用甲苯定容，配制成混合农药的标准溶液，置于4℃冰箱中保存。

1.2.2 仪器条件

质谱条件：HP-5 MS石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25µm）；电子轰击离子源，电离电压为70 eV，扫描方式：选择离子监测（SIM）模式，离子源温度为230℃；四极杆温度为150℃；传输线温度：280℃。

色谱条件：进样口温度：250℃；柱箱温度：60℃保持1 min，20℃/min升到160℃，2℃/min升到210℃，总运行时间31 min，溶剂延迟时间5 min；载气为氦气，流速1 mL/min。

1.2.3 样品的提取

样品来源于黑龙江省呼兰果园村大田试验地秋天成熟红甜菜块根。准确称取切碎的红甜菜样品25 g，加入50 mL乙腈匀浆3 min，然后过滤到事先装有5 g氯化钠的具塞量筒中，剧烈震摇2 min，静止30 min以上，吸取上清液10 mL，60℃旋转蒸发至干，2 mL正己烷-丙酮（2:1）定容，待净化。

1.2.4 样品的净化

在15 mL离心管中加入10 mg MWCNTs、25 mg PSA、75 mg MgSO4作为吸附剂。吸取上述提取液1 mL，涡旋振荡1 min，以6 000 r/min离心1 min，取上清液过0.22µm有机滤膜后供气相色谱-质谱测定。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的确定

每种待测物分别选择一个定量离子，2～3个定性离子，SIM模式扫描，10种农药在色谱图中的保留时间、定量离子和定性离子如表1所示。按照出峰顺序分时段分别检测得到总离子流图（图1）。其中，毒死蜱、倍硫磷、对硫磷、三唑酮保留时间相差较小，而在本文中每种物质选用不同的提取离子进行定量，保留时间对结果无影响，图2为4种农药的提取离子流图，利用峰面积法对结果进行定量。

表1 10种农药的保留时间、定量离子、定性离子Table1 Retention time,quantitative ions,qualitative ions of the10 pesticideresidues

图1 10种农药混合标准溶液的气相色谱-质谱图Fig.1 GC-MSchromatogram of the mixtureof the 10 pesticideresidues

图2 毒死蜱（chlorpyrifos）、倍硫磷（fenthion）、对硫磷（parathion）、三唑酮（triazolone）提取离子流图Fig.2 Extract ions chromatogram of chlorpyrifos，fenthion，parathion，triazolone

2.2 前处理条件的选择

2.2.1 提取溶剂的选择

在农药残留分析中，常用的提取溶剂有丙酮、乙腈、甲醇、乙酸乙酯等，因为丙酮与水互溶，很难实现有机相和水相分离，作为单一溶剂提取时适合含色素较少的样品，乙酸乙酯虽只是部分与水互溶，但一些极性农药却不能从水相中分离。而乙腈提取的样品基质相较于丙酮和乙酸乙酯含有的干扰物质较少，10种农药回收率在68%～120%之间，满足农药残留分析要求，并且通过盐析和离心很容易从水相中分离，因此选择乙腈做为提取溶剂。

2.2.2 净化方法的确定

乙腈提取之后的溶液，会有色素、酚类、醌类等物质混入提取液中，必须通过净化除去，否则会干扰测定结果，影响仪器的灵敏度。选择合适的净化方法是至关重要的。本实验选用分散固相萃取的方法，考察了吸附剂对农药残留回收率的影响。

农药残留常用的吸附剂有PSA、MgSO4、GCB、C18等，PSA含有两个氨基，是弱阴离子交换吸附剂，对于样品中有机酸、色素、维生素、糖类以及其他能形成氢键的成分等能有效去除，但其吸附色素的能力有限，因此需要与其他吸附剂组合使用；无水MgSO4用作除去提取液中可能存在的水分，也不能单独使用；C18是反相吸附剂，可以去除脂类、花青素、蜡类等非极性的干扰物质；GCB能吸附极性化合物或做阴离子交换剂，因此，它既可以吸附非极性和弱极性的化合物又可以吸附极性化合物，用来去除色素，对化合物表现出很广的吸附谱；MWCNTs对多种有机化合物具有良好的吸附性，只需使用少量的吸附剂即可在较短的平衡时间内实现萃取分离。所以实验中固定PSA和MgSO4的用量，考察MWCNTs、GCB、C18三种不同吸附剂的净化效果。

PSA和MgSO4的用量分别为25 mg和75 mg，在净化管中分别加入3种吸附剂40 mg，MWCNTs组合净化后的提取液颜色最浅，净化效果最好，其次为GCB组合，C18的净化效果最差，颜色最深。从加标回收率来看，MWCNTs、GCB相差较小，优于C18的回收率（图3）综合净化效果和加标回收率，最终选择MWCNTs/PSA/MgSO4作为分散固相萃取吸附剂。

图3 不同吸附剂对加标空白样品提取回收率的影响Fig.3 Effect of the different sorbents on theextraction recoveries of pesticides spiked in red beet

2.2.3 MWCNTs用量的确定

比较不同用量的MWCNTs对红甜菜提取液的净化效果及回收率，实验中固定PSA和MgSO4的用量，分别加入10 mg、20 mg、30 mg、40 mg、50 mg MWCNTs于净化管中，随着MWCNTs用量的增加，溶液MWCNTs颜色逐渐变浅，回收率随着升高，但加到40 mg以上到50 mg时，回收率开始下降，说明MWCNTs用量达到一定值，会对目标物质产生吸附，所以综合考虑，选择MWCNTs的用量为40 mg（图4）。

2.3 方法学考察

2.3.1 方法的灵敏度

分别配置浓度为0.01～0.5 mg/L的混合农药标准溶液，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线（表2），得线性方程及相关系数，10种农药在10μg/L～0.5 mg/L（甲拌磷为30μg/L～0.5 mg/L）范围内线性关系良好，相关系数（R2）均大于0.99。

图3 不同吸附剂对加标空白样品的提取回收率的影响Fig.3 Effect of thedifferent sorbents on the extraction recoveriesof pesticidesspiked in the red beet

方法的灵敏度一般用检出限表示，一般情况下，信噪比为10（S/N=10）时对应的浓度定义为定量限（Limit of quantitation，LOQ），以3倍信噪比（S/N=3）定义为检出限（Limit of detection，LOD），结果（表2）表明：LOD为1～9μg/kg，LOQ值为10～20μg/kg，表明此方法灵敏度较高。

表2 10种农药的回归方程Table2 Theregression equation of the10 pesticideresidues

2.3.2 准确度与精密度实验

农药残留检测中，一般用添加回收率来验证方法的准确度，用相对标准偏差（RSD）来表示测试结果的精密度。本文在确定的实验条件下，依据不同农药的检出限，分别向红甜菜样品中加入农药标准品的混合溶液，按照1.2.3和1.2.4的方法，进行高、中、低（分别为10～30μg/kg，0.1 mg/kg，0.5 mg/kg）3个水平的加标回收率实验，其中每个浓度做6次重复。实验结果表明：在3个加标水平下，10种农药的平均回收率为73.8%～99.2%，RSD值为2.3%～8.2%，方法准确度与精密度满足农药残留分析要求（表3）。

表3 10种农药在红甜菜中的加标回收率和相对标准偏差Fig.3 Recoveries and relative standard deviations(RSDs)for the10 pesticides spiked in red beet(n=6)

3 结论与讨论

建立了以PSA、MgSO4、MWCNTs组合作为吸附剂分散固相萃取、GC-MS测定红甜菜中多种农药残留的测定方法。此前处理方法步骤简单、快速、回收率及精密度均满足要求，可降低检测成本、缩短检测周期。为红甜菜中农药残留检测提供了有效的前处理方法及检测手段。

目前，针对不同的基质，农药残留的前处理方法很多，具体包括索氏提取法，液液萃取法，固相萃取法、固相微萃取法等，其中最常用的是固相萃取法，国家标准GB 23200.8-2016及行业标准NY/T 761-2008中对于多残留的前处理均采用了此方法，需要几种固相萃取小柱组合使用，操作起来较为繁琐，而且对操作者要求更高。本方法采用MWCNTs分散固相萃取的方法，利用MWCNTs的吸附特性，具有成本低、操作简单的优点。

10种农药中，包括有机磷农药8种，三唑类农药（三唑酮），氨基丙酸甲酯类（甲霜灵）农药。有机磷农药一般使用气相色谱-火焰光度检测器进行测定，但是需要保留时间定性，对于保留时间比较接近的农药定性困难，极容易出现假阳性，例如本文中的毒死蜱、倍硫磷等4种农药，而采用气质联用完全可以避免这一难题。三唑酮一般用气相色谱-电子捕获检测器进行测定，灵敏度较高，GB 23200.8-2016中包括甲霜灵的测定方法，但是前处理比较复杂。本文进行了不同种类农药的联合测定，充分发挥了气相色谱的高分离能力与质谱优秀的定量能力，对分析成分复杂的样品具有无比的优越性。同时，采用选择离子监测模式，有效地排除了基质干扰，具有较高的准确度及灵敏度。