裂叶荨麻对糖尿病小鼠肝脏损伤的保护作用

杨文娟,程世蕊,马养民,龚 频,何亚娟,胡 媛,毛跟年

(1.陕西科技大学食品与生物工程学院,陕西西安 710021;2.陕西科技大学化学与化工学院,教育部轻化工助剂化学与技术重点实验室,陕西西安 710021)

糖尿病是危害人体健康的非传染性慢性疾病之一,持续高血糖状态可造成肝脏损伤,据报道,糖尿病人群中肝病发病率约50%[10]。由于肝脏代偿作用较强,早期糖尿病并发肝脏损伤不明显,但其累积效应会导致肝功能丧失而危及生命[11-12]。现代医学研究表明糖尿病性肝病病因与高糖诱导的氧化应激异常有关,引起机体特异性免疫反应,以致糖脂代谢紊乱、微血管病变及微循环障碍[13]。目前关于裂叶荨麻对糖尿病引起肝脏损伤的保护作用未见报道。

本研究采用STZ诱导构建Ⅱ型糖尿病小鼠模型,从氧化应激角度探讨裂叶荨麻在糖尿病性肝损伤的保护作用,以期为裂叶荨麻相关保健产品的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

清洁级ICR小鼠 60只,雄性,体质量(20±2) g,由西安交通大学医学院动物实验中心提供,动物生产许可证号SCXK(陕)2017-003,自由饮食饮水,12 h交替光照,SPF环境饲养;裂叶荨麻药材 采自陕西省旬阳县,经陕西中医药大学颜永刚教授鉴定为荨麻科裂叶荨麻(UrticafissaE.Pritz.)的根茎;链脲佐菌素(STZ) 美国Sigma公司,溶解于0.1 mol/L(pH4.4)柠檬酸盐缓冲液,临用前配制;ACCU-CHEK活力型血糖试纸 罗氏诊断试剂公司;考马斯亮蓝G-250 瑞士阿达玛斯公司;SOD、MDA、CAT试剂盒 南京建成生物工程研究所;其他试剂均为分析纯。

全活力血糖仪 德国罗氏公司;Varioskan Flash全波长扫描式多功能读数仪 芬兰THERMO;BSASS2S电子天平 德国赛多利斯科学仪器有限公司;PHS-3C精密PH计 上海仪电科学仪器股份有限公司;WH3微型涡旋混合仪 上海沪西分析仪器厂有限公司;DM2500/DFC正置式显微镜 德国Leica。

1.2 实验方法

1.2.1 裂叶荨麻提取物的制备 取裂叶荨麻根茎适量,粉碎,过40目筛,10倍量70%乙醇回流提取2 次,每次1 h,减压浓缩,冻干(-50 ℃,6 h),临用前配制1 g生药/mL的溶液。

1.2.2 动物模型的建立及给药 健康ICR小鼠60只,适应性饲养7 d,随机取10只作为空白组,其余小鼠禁食12 h后,腹腔注射STZ溶液(75 mg/kg),连续注射2 d,1次/d,72 h后小鼠尾静脉取血测空腹血糖,血糖值高于11.1 mmol/L即为造模成功。取造模成功的小鼠40 只随机分为模型组、荨麻低剂量组(100 mg/kg)、荨麻中剂量组(200 mg/kg)、荨麻高剂量组(400 mg/kg),每组10只;空白组和模型组给予生理盐水,各药物组按照相应剂量灌胃,给药量均为0.1 mL/10 g,1次/d,连续给药30 d。

1.2.3 体质量和肝脏指数的测定 小鼠体质量的测定:于实验的第0、5、10、15、20、25、30 d测定小鼠体质量,并记录。

肝脏指数的测定:末次给药后小鼠脱颈椎处死,迅速取出肝脏,冷生理盐水漂洗,称湿重,计算肝脏指数。

肝脏指数(%)=(肝脏质量/体质量)×100

1.2.4 肝脏组织病理观察 取相同部位肝脏组织,生理盐水冲洗后用10%中性甲醛固定,石蜡包埋,切片厚度5 μm,苏木素-伊红(HE)染色,光学显微镜下进行组织病理观察。

1.2.5 MDA、PCO含量及SOD、CAT活性的测定 取适量肝脏制备10%的肝组织匀浆,3000 r/min离心10 min,取上清,测定MDA、PCO含量及SOD、CAT活性,肝脏蛋白羰基化程度用2,4-二硝基苯肼法测定,其余指标测定的具体操作按照试剂盒方法进行。

1.3 统计学处理

采用Origin 8.5作图,SPSS 19.0软件进行统计学分析,组间比较采用ANOVA分析,p<0.05为差异具有统计学意义,p<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 裂叶荨麻对糖尿病小鼠体质量和肝脏指数的影响

如图1所示,给药前各组小鼠体质量较为均一,空白组小鼠体质量增长趋势符合小鼠生长规律,模型组小鼠由于STZ造成胰岛细胞损伤,血糖升高,体质量增长明显减缓,与糖尿病“三多一少”中体重减少的临床症状相符;裂叶荨麻各剂量组小鼠从给药15 d起,体质量出现明显增长趋势,高剂量组小鼠给药30 d时的体质量接近正常小鼠,表明裂叶荨麻提取物可以一定程度缓解糖尿病引起的体重降低。

图1 裂叶荨麻对小鼠体质量的影响

由图2可知,与空白组相比,模型组小鼠的肝脏指数增加(p<0.01),表明糖尿病小鼠肝脏可能出现严重损伤,引起肝脏质量增大;与模型组相比,裂叶荨麻高、中剂量组小鼠肝脏指数显著低于模型组(p<0.01,p<0.05),表明经裂叶荨麻提取物处理后,糖尿病小鼠的肝脏损伤有一定程度改善。

图2 裂叶荨麻对小鼠肝脏指数的影响

2.2 裂叶荨麻对糖尿病小鼠肝脏组织形态的影响

如图3所示,空白组小鼠肝小叶结构正常,排列整齐,围绕中央静脉向四周放射状排列,肝细胞多角形,无肿胀,细胞中间有圆形细胞核(★);模型组小鼠可见肝小叶界限不清,肝细胞排列紊乱,出现肿胀、气泡样病变(☆),细胞密度减低,形态不规则,有大量炎性细胞浸润。荨麻各剂量组治疗后肝脏病变有不同程度减轻,细胞肿胀减轻(▲),高、中剂量组缓解作用较明显。由此可知,裂叶荨麻能够缓解糖尿病小鼠肝脏形态病理损伤,具有一定程度保护作用。

图3 裂叶荨麻对糖尿病小鼠肝脏形态组织学改变的影响(HE,200×)

2.3 裂叶荨麻对糖尿病小鼠肝脏氧化损伤指标的影响

如图4所示,模型组糖尿病小鼠肝脏组织脂质过氧化物MDA增多,与空白组相比,有显著性差异(p<0.05),经荨麻提取物处理后,可以减少肝组织MDA的生成,高剂量组差异有显著性(p<0.05),表明糖尿病可以诱发肝脏的脂质过氧化反应,而裂叶荨麻可以抑制体内的脂质过氧化物的产生。

图4 裂叶荨麻对糖尿病小鼠肝脏脂质过氧化的影响

由图5可知,糖尿病组小鼠PCO含量增加,与空白组相比,差异极显著(p<0.01),表明糖尿病对肝脏蛋白质产生明显损伤,而裂叶荨麻各剂量组能够降低体内PCO水平,高剂量组保护作用具有统计学意义(p<0.05)。结果表明,糖尿病可以加速肝脏蛋白质羰基化[14],而裂叶荨麻可以减轻肝脏蛋白质氧化应激状态。

图5 裂叶荨麻对糖尿病小鼠肝脏蛋白羰基化的影响

2.4 裂叶荨麻对糖尿病小鼠肝脏抗氧化酶活性的影响

如图6所示,与空白组相比,糖尿病组小鼠SOD活力降低,差异极显著(p<0.01),裂叶荨麻各剂量组能够恢复酶的活性,提高SOD水平,高、中剂量组保护作用显著(p<0.01,p<0.05),表明糖尿病显著抑制了肝脏超氧化物歧化酶的活性,而裂叶荨麻可以减轻肝脏氧化应激状态。

图6 裂叶荨麻对糖尿病小鼠肝脏超氧化物歧化酶的影响

由图7可知,模型组糖尿病小鼠肝脏CAT活性明显降低,与空白组相比,差异极显著(p<0.01),而裂叶荨麻各剂量组可以延缓肝脏组织CAT活力的降低,各剂量组均有显著性差异(p<0.01,p<0.05),表明糖尿病降低了肝脏过氧化氢酶的活性,裂叶荨麻可以一定程度恢复酶的活性,缓解CAT的降低。

图7 裂叶荨麻对糖尿病小鼠肝脏过氧化氢酶活性的影响

3 讨论与结论

糖尿病长期高血糖状态可造成代谢紊乱,诱发肝脏、心脏、肾脏等重要脏器损伤,导致许多并发症的出现[15]。其中肝病在糖尿病中发病率较高,高血糖介导的氧化应激在糖尿病性肝脏损伤的发生发展中起着重要作用,由于血糖累积,肝脏代偿有限,最终可发展为非酒精性肝病、肝纤维化、肝硬化等,严重危及生命[16-18]。研究表明荨麻中黄酮类、多酚、鞣质等成分能够调节小鼠体内SOD、CAT、GSH活性,减少MDA、PCO水平,也具有较强的体外清除自由基能力[19]。本研究通过建立STZ诱导Ⅱ型糖尿病小鼠模型,STZ损伤小鼠胰岛β细胞,使胰岛素分泌不足造成糖尿病。糖尿病典型症状为“三多一少”,即饮食饮水尿量增多、体重减少,裂叶荨麻提取物能够缓解糖尿病引起的体重减轻,控制糖尿病小鼠体重,并且减轻了肝脏损伤,降低了肝脏指数;糖脂代谢紊乱可导致肝脏组织形态学改变,肝细胞受损,本研究通过HE染色观察肝脏组织基本形态,糖尿病小鼠肝脏细胞排列紊乱,肿胀明显,细胞密度减低,裂叶荨麻高、中剂量组对上述组织病理形态均有所改善,高剂量组改善作用明显。因此,从上述生理指标及组织形态学反映出裂叶荨麻具有对糖尿病小鼠肝脏损伤的保护作用。

MDA是细胞膜脂质过氧化产物之一,其可进一步与磷脂酰乙醇胺和蛋白质交联,使细胞脆性增加和变形性降低,从而导致生物膜结构和功能的改变[20],PCO是蛋白质分子被自由基氧化修饰的一个重要标志物,它产生于活性氧攻击氨基酸分子中的自由氨基或亚氨基后最终生成的NH3和相应的羰基衍生物,因此,测定MDA和PCO含量能间接反映氧化应激状态下机体受损伤的程度。实验结果显示,裂叶荨麻减少了MDA、PCO含量,具有降低糖尿病小鼠肝脏氧化应激损伤的作用。

SOD和CAT是体内重要的抗氧化酶,是调节机体自由基及活性氧生成的重要因素,而糖尿病代谢紊乱状态导致抗氧化酶活性被破坏[21-23],糖尿病小鼠的SOD和CAT活性显著降低,裂叶荨麻提取物可能通过对体内自由基的清除作用,减少氧化物的生成,进而提高肝脏中SOD和CAT活性,这可能是其保护糖尿病小鼠肝脏损伤的作用机制之一。

综上所述,本实验研究了裂叶荨麻提取物在不同剂量下对肝脏氧化损伤指标及抗氧化酶活性的影响,证明了裂叶荨麻能够显著改善糖尿病小鼠肝脏损伤状态,减轻肝脏病理形态,对肝脏氧化损伤具有明确的缓解作用,这一结论为裂叶荨麻在糖尿病人群的保健食品开发领域提供了新的方向和思路,但有待进一步研究,以期探讨具体物质基础及作用机制。