皖北地区窖泥类芽孢杆菌发酵风味物质的研究

吴文睿,刘飞翔,方颂平,蒲顺昌

(亳州学院生物与食品工程系,安徽亳州 236800)

浓香型白酒以其典型风格,深受广大消费者喜爱,它占据着我国白酒市场份额的70%[1-2]。窖泥是浓香型白酒生产酿造过程中的基础物质之一,为酿酒微生物提供了丰富的营养物质,也是具有生香功能微生物的富集场所[3]。窖泥中长期驯化的微生物种群及其代谢产物相互制约、相互协调、相互作用,为酒体香味物质的形成提供反应底物,为浓香型白酒质量和典型风格的形成奠定基础[4]。

近年来,随着食品风味各种分析仪器的快速发展,我国研究人员对白酒中的各种风味物质及其形成机理进行了深入的研究。许多学者,从酒醅和窖泥中分离得到相关功能性微生物,并对其发酵后的风味物质进行分析,以探究其在白酒酿造中的作用。例如,钟姝霞等[5]从酱香型酒醅中筛选出5株芽孢杆菌,并采用气相-质谱联用分析技术(GC-MS)对其发酵后代谢产物进行分析,结果表明:主要产物为3-羟基-2-丁酮,以及少量的2,3-丁二醇和酯类等芳香物质。赵辉等[6]从白酒窖泥中筛选及鉴定了高产己酸的三株细菌,已应用于窖池保养及人工窖泥培养。杨春霞等[7]从牛栏山二锅头酒醅中分离筛选出5株芽孢杆菌,并对其发酵后的风味物质进行分析,结果显示其代谢产物均含有十几种风味物质,且含有许多重要的酯类物质。

我国安徽北部地区由于季风明显,气候温和,光照充足,雨量适中,无霜期长,四季分明,春温多变,夏雨集中,秋高气爽,冬长且干的独有的天然地理环境,聚集着许多的白酒生产基地,在香型类别上均属于浓香型白酒,其中以古井、金种子、高炉家和文王等为代表[8]。我们已对皖北地区的窖泥微生物进行分离,得到许多窖泥微生物的菌种,许多是浓香型白酒重要功能性微生物。目前对白酒的微生物研究多集中在芽孢杆菌、酵母等酿造功能菌上,对窖泥中类芽孢杆菌的研究较少,通过对类芽孢杆菌的研究,可探索类芽孢杆菌菌种代谢产物与酒中风味物质的关系。本实验选取其中分离得到的类芽孢杆菌属Paenibacilluslautus(P.lautus)、Paenibacilluswynnii(P.wynnii)、Paenibacillustarimensis(P.tarimensis)进行研究,采用固相微萃取法对三株类芽孢杆菌株的发酵液进行萃取,然后采用GC-MS分析检测其发酵液中风味物质的组成,通过分析具有产风味物质能力菌株的代谢产物,探求各菌种代谢产物与酒中风味物质的关系。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

类芽孢杆菌菌种:P.lautus、P.wynnii、P.tarimensis从皖北地区窖泥中分离鉴定。

TOMY SX-70高压灭菌锅 日本TOMY;Heratherm IMH400-S生化培养箱 美国Heratherm;MaxQ 485HP震荡培养箱 美国Thermo;Allegra 64R高速离心机、Agilent PC420固相微萃取仪 美国安捷伦科技有限公司;Waters I-Class/Xevo TQD气相色谱-质谱联用仪(GC-MS) 美国沃特世科技有限公司(Waters);CAR/PDMS 75 μm顶空固相萃取头 美国SUPELCO公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基配方 菌种活化培养基:蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、葡萄糖3%、氯化钠0.05%、硫酸铵0.09%、硫酸铁0.01%、硫酸镁0.03%、氯化钙0.5%、酒醅浸提液、琼脂2%、pH7.0。

种子培养培养基:蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、葡萄糖3%、氯化钠0.05%、硫酸铵0.09%、硫酸铁0.01%、硫酸镁0.03%、氯化钙0.5%、酒醅浸提液、pH7.0。

发酵培养基:糖化液(玉米、高粱、大米)9%、蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、硫酸铵0.09%、硫酸镁0.03%、pH7.0。

1.2.2 发酵液的制备 菌种活化:将保藏菌种接种于菌种活化培养基斜面上,35 ℃条件下活化24 h。

种子培养:从经活化后的新鲜试管斜面上取两环菌种,接种到装有15 mL种子培养基的25 mL摇瓶中,在35 ℃,140 r/min条件下培养24 h,制备种子液。

发酵培养:取上述种子液15 mL接种于发酵培养基(250 mL的三角瓶,装液量150 mL)中,在140 r/min,35 ℃条件下摇床培养72 h。以接种15 mL种子培养基作为空白对照。

1.2.3 发酵液的前处理 菌种发酵液GC-MS分析的前处理:吸取发酵液与无水乙醇按1∶1比例混合均匀后,静置30 min,在10 ℃条件下离心,转速3000 r/min,离心10 min,取上清液先进行粗过滤,再用0.22 μm的水相滤膜过滤,得滤液,用移液管吸取滤液8 mL加入到顶空瓶中,称取氯化钠3.0 g加入到顶空瓶中,并加入一颗搅拌磁子,设置磁力搅拌器温度为50 ℃,转速400 r/min,PDMS萃取头顶空萃取30 min。

1.2.4 气相色谱质谱联用仪分析 气相质谱联用仪分析条件:不分流流速0.9 mL/min;进样口温度:230 ℃;升温程序:35 ℃保持4 min,以2 ℃/min升温到60 ℃不保持,以6 ℃/min 升温到180 ℃保持15 min;色谱与质谱接口温度:230 ℃;电离方式:电子轰击源(EI);检测方式:全扫描模式;电离能量:70 eV。

1.3 数据处理

经过气相色谱-质谱联用仪进样分析后,使用仪器Chemstation数据处理软件,对样品全分析谱图进行解析,导出样品中风味物质的峰面积,计算面积百分比。

2 结果与分析

2.1 整体风味化合物分布情况

按照实验方法,将类芽孢杆菌属的3株菌的发酵液和空白培养基经固相微萃取等前处理后,用GC-MS分析其风味化合物的种类以及相对含量,总离子色谱图见图1～图4。由总离子色谱图可知,3株类芽孢杆菌属菌的发酵液中的风味化合物种类数量明显高于空白对照。

图1 空白培养基气质分析总离子色谱图Fig.1 GC-MS total ions chromatogram of blank medium

图2 Paenibacillus wynnii发酵液气质分析总离子色谱图Fig.2 GC-MS total ions chromatogram of flavor compounds in the fermentation of Paenibacillus wynnii

图3 Paenibacillus tarimensis发酵液气质分析总离子色谱图Fig.3 GC-MS total ions chromatogram of flavor compounds in the fermentation of Paenibacillus tarimensis

图4 Paenibacillus lautus发酵液气质分析总离子色谱图Fig.4 GC-MS total ions chromatogram of flavor compounds in the fermentation of Paenibacillus lautus

由图5分析可知,三株类芽孢杆菌属的发酵风味物质种类主要集中在酯类、醇类、醛酮类和杂环类四类上,这些化合物与白酒中的微量成分种类基本一致[9]。其中,P.wynnii和P.lautus发酵的风味物质中,酯类和醇类的相对含量较高;而P.tarimensis发酵的风味物质中,杂环类化合物的相对含量较高。酯类和醇类物质是白酒中微量成分占比比较大,为浓香型白酒中主体香贡献较大。杂环类(酚类、呋喃类等)化合物虽在白酒中的成分极微量,但其阈值往往较低,对白酒的典型风格香味上仍有较高的贡献[10]。

图5 类芽孢杆菌属发酵液的风味化合物分布情况Fig.5 The distribution of flavor compounds in the fermentation by Paenibacillus

2.2 主要风味物质分析

由表1可知,P.wynnii、P.tarimensis和P.lautus的发酵液中分别鉴定出58、26和39种风味化合物。P.wynnii主要发酵产物是3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(4-乙烯基愈创木酚)、己酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯、十四酸乙酯、棕榈酸乙酯等,其产酯物质较多,酯类物质是酒中的主要的呈香物质,而且己酸乙酯是浓香型白酒的主体香[11]。P.tarimensis主要发酵产物是2,4-二叔丁基苯酚、3-羟基2-丁酮、2,3-丁二醇、2-甲氧基苯酚、2.3-二氢苯并呋喃、己酸乙酯、乙酸苯乙酯、辛酸乙酯、香叶醇、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(4-乙烯基愈创木酚)等。P.lautu主要发酵产物是2,3-丁二醇、己酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯、己酸己酯、棕榈酸乙酯等,产酯物质较多。酯类化合物是白酒中除乙醇和水以外含量最多的一类组分。它约占总组分含量的60%,白酒中酯类化合物多以乙酯形式存在。在白酒的香气特征中,绝大部分是以突出酯类香气为主的。在酒体中,一些含量较高的酯类,由于它们的浓度及气味强度占有绝对的主导作用,使整个酒体的香气呈现出以酯类香气为主的气味特征,并表现出某些酯原有的感官气味特征。浓香型白酒中的已酸乙酯,在酒体中占有主导作用,使浓香型白酒的香气呈现出以己酸乙酯为主的香气特征。

表1 类芽孢杆菌属菌发酵液气质分析结果Table 1 The analysis of GC-MS results of flavor compounds in the fermentation by Paenibacillus

续表

P.wynnii和P.tarimensis的发酵产物中均有较高含量的3-羟基-2-丁酮,相对含量分别为12.65%和14.17%。3-羟基-2-丁酮又名乙偶姻,是令人喜爱的食用香料,具有特有的奶油香味,在酒中是一种重要的芳香成分,赋予酒的浓厚,可使酒产生优良的风味[12]。此外,许多研究表明3-羟基-2-丁酮是四甲基吡嗪的重要前体物质,并且在这两株菌中的发酵液中均检测到了四甲基吡嗪的存在,这可能是以3-羟基-2-丁酮为前体物质转化而来[13-15]。P.wynnii、P.tarimensis和P.lautus均含有较高的2,3-丁二醇,其含量分别为22.21%、11.67%和40.30%。研究表明,2,3-丁二醇是白酒中重要的多元醇之一,是主要甜味芳香物质,能使酒醇厚绵甜,有自然感[16]。

P.tarimensis的发酵产物还含有较高的杂环类化合物,如2-甲氧基-4-乙烯基苯酚(4-乙烯基愈创木酚,12.54%)、2-甲氧基苯酚(8.50%)、2.3-二氢苯并呋喃(7.04%)等。一直以来,酒中的酚类化合物被认为是饮料酒中有重要贡献的香气物质[17]。其中4-乙烯基愈创木酚主要存在于玉米酒精发酵的挥发物中,其感官阈值很低,仅为0.3 mg/L,痕量存在时也能呈现发酵香气、酚味、药香味、丁香味或烟熏味、略带甜味,是决定酒类、酱油、茶叶、干酪、咖啡等食品的主要香味成分,也是日化、医药、香精合成等行业较为常用的高档香料之一[18-19]。白酒中含有3-羟基-2-丁酮、2.3—丁二醇,被认为它是白酒质量的重要成分,在白酒中起着缓冲、平衡的作用,能是酒产生优良的酒香和绵甜的口味,同时白酒中3-羟基-2-丁酮及2.3-丁二醇是呈甜味物质,并有助香作用,特别是在回味上使之有醇厚感,能使酒醇厚绵甜,有自然感。

3 讨论与结论

以皖北地区窖泥中的类芽孢杆菌属菌P.wynnii、P.tarimensis和P.lautus为研究对象,通过检测分析发现,这三株菌株均是很好的窖泥功能菌。P.wynnii和P.lautus的发酵液中分别鉴定出58和39种风味化合物,且以酯类物质为主;P.tarimensis的发酵液中分别鉴定出26种风味化合物,主要以具有芳香味杂环类化合物为主;此外,3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇和4-乙烯基愈创木酚等也有较高相对含量,它们也均是白酒中的重要呈香呈味物质,这些菌产生的主要香气成分是白酒重要的香味物质,对白酒是香气贡献是正向。因此,从窖泥中筛选到的类芽孢杆菌属的发酵代谢产物与酒中主要风味物质的关联较大,研究结果可为进一步深入研究浓香型白酒的风味物质形成机制、微生物代谢机理、发酵生产工艺及技术改进等提供一定的理论和技术支持。