川芎醇提物抗氧化活性及抗食源性致病菌特性分析

葛慧芳,孙明飞,叶 佳,陈继承

(福建农林大学食品科学学院,福建福州 350002)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[1-2]、大肠杆菌(Escherichiacoli)[3]、沙门氏菌(Salmonella)[4]、铜绿假单胞菌(Pseudomonas)[5]及枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)[6]等食源性致病菌广泛存在于日常饮食中,引起食品腐败,造成重大经济损失的同时,误食还会引发胃炎、肠炎、呼吸道感染等不同程度的疾病,已成为全球严重的公共卫生问题。目前,化学试剂虽能实现防腐保鲜,但对人体造成的危害不容小觑,研究和开发天然防腐剂显的尤为重要。中草药具有高效、低毒、无污染以及广谱抗菌性等优点,应用于食品的防腐与保鲜效果显著[7-8],且市场前景广阔。

川芎药材是伞形科植物川芎(Ligusticumchuanxiong)干燥根茎,主要活性成分包括阿魏酸[9-10]、川芎嗪[11]、挥发油等,其中生物碱川芎嗪(TMP)又是食品中Maillard反应的重要风味产物[12],常用来做为食品添加剂。临床研究发现川芎具有清除自由基[13]、抑制脂质过氧化[14]、抗菌消炎[15]等作用。川芎临床复方制剂 “十味败毒汤”、“四物汤”就有较好的抗菌活性[16-17]。孔秋莲等[8]将川芎作为天然防腐剂应用于果蔬的加工与贮藏,可以很好地抑制真菌的生长。阿魏酸也具有较好的抗菌消炎[18-19]、抗病毒作用[20]。肖乃玉[21]通过将阿魏酸与胶原蛋白相结合制备出抗菌膜应用于腊肠的保鲜,可以很好地延长腊肠的货架期。但目前有关川芎醇提物抗氧化及抑制食品中常见致病菌的研究鲜见报道。本研究分析了川芎醇提物的还原力、总抗氧化能力、对羟自由基和超氧阴离子的清除效果及其对常见食源性致病菌的抑制效果,为川芎醇提物应用于食品防腐保鲜提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌 均由福建农林大学微生物室提供;川芎 产地四川,生产许可证20160084;TMP、没食子酸及阿魏酸标品及福林试剂 上海源叶生物科技有限公司;阿莫西林分散片 石药集团中诺药业有限公司;总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒、羟自由基测定试剂盒、超氧阴离子测定试剂盒 南京建成生物工程研究所;营养琼脂(蛋白胨10.0 g/L、牛肉粉3.0 g/L、氯化钠5.0 g/L、琼脂15.0 g/L)、EC肉汤(胰酪胨20 g/L、3号胆盐1.5 g/L、磷酸氢二钾4.0、磷酸二氢钾1.5 g/L、乳糖5.0 g/L、氯化钠5.0 g/L) 北京陆桥股份有限公司;其他试剂 国药集团化学试剂有限公司。

G154 DWS立式自动压力蒸汽灭菌器 厦门致微仪器有限公司;HBS-1096A酶标分析仪 南京德铁实验设备有限公司;FDU-1200真空冷冻干燥机 上海爱朗仪器公司;LC-2030C岛津高效液相色谱仪 日本岛津制作;BSD-150震荡培养箱 上海博迅实业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 川芎醇提物与菌液的制备 称取川芎粉末5 g,加95%乙醇浸润0.5 h后,按照1∶8 (v/v)加入95%乙醇回流提取2次,每次提取1.5 h,合并提取液后用旋转蒸发仪浓缩至2 mL,并至-20 ℃冷冻,最后用冷冻干燥机冻干,得黄褐色川芎醇提物干燥粉末[13]。

从4 ℃冰箱里取上述5种致病菌菌株各一管(菌接种于试管斜面培养基中,培养后于4 ℃冰箱内保存,分别加入pH7.4 的PBS缓冲液5 mL进行洗脱得5种菌原液,再用pH7.4 的PBS缓冲液5倍稀释后使用。

1.2.2 川芎醇提物活性成分测定 参照Ge等[13]的方法测定川芎醇提物中TMP、阿魏酸及游离酚结合酚的含量。其中TMP与阿魏酸的测定采用HPLC法。HPLC色谱条件:C18柱(4.6 mm×150 mm);进样量:10 μL。流动相:甲醇-1%冰醋酸溶液(45∶55,V/V);流速:1 mL/min;检测波长:310 nm。实验中TMP、阿魏酸及没食子酸的标准曲线分别为:y=8.97x-40.32(R2=0.9994);y=16884x+36257(R2=0.9944)。

游离酚与结合酚通过丙酮与碱提取制得,再用福林酚法测定含量。具体操作如下:用80%丙酮(1∶5,V/V)提取川芎醇提物中的游离酚,用2 mol/L NaOH去碱化川芎醇提物后再用80%丙酮(1∶5,V/V)提取,制得总酚酸,结合酚的含量为总酚酸与游离酚的差值。最后以蒸馏水为参照,通过96孔板测定不同浓度样品的吸光度。每孔加样品50 μL、0.2 mol/L福林试剂100 μL,再加100 μL 7.5% Na2CO3,避光反应10 min后在760 nm处测定吸光度。实验中以没食子酸标品为参照,其标准曲线方程为y=0.0017x+0.0422(R2=0.9995)。

1.2.3 川芎醇提物还原力测定 参照王振斌的方法[22],取VC标准品配制成20、40、60、80、100 μg/mL的标准溶液,取不同浓度VC溶液各1 mL,分别加入2.5 mL pH6.6 PBS与2.5 mL 1%铁氰化钾,充分混匀后于50 ℃反应20 min,冷却后取上清液2 mL与2 mL蒸馏水、0.4 mL 0.1%三氯化铁混匀,室温反应10 min后于700 nm处测定吸光度,并绘制标准曲线,得标准曲线方程为:y=0.0084 x+0.0377(R2=0.997)。20 mg/mL川芎醇提物100倍稀释后,以VC为对照测定吸光度A值,将A代入标准曲线中即可得出提取物相对VC的还原力大小。

1.2.4 川芎醇提物抗氧化能力测定 川芎醇提物清除超氧阴离子与羟自由基的效果及总抗氧化能力的测定参照试剂盒说明书进行。其中以不同浓度VC标准品为阳性对照。

1.2.5 试药抑菌效果测定 取100 μL菌与营养琼脂培养基混匀,冷却凝固后均匀打孔,每孔中分别加入30 μL的抑菌剂,于37 ℃生化培养箱中培养18 h后,测定各培养皿中透明抑菌圈的大小,每组3个平行。本次试验中各抑菌剂分别为:125 g/L的阿莫西林水溶液、100 g/L的TMP水溶液(50 ℃溶解)、浓度分别为75、100、150及200 g/L的川芎醇提物水溶液(此处选择水溶液是避免乙醇的杀菌作用干扰,本试验中各抑菌剂均能溶于水)。

1.2.6 川芎醇提物抑制食源性致病菌MIC及MBC测定 采用二倍比稀释法[23]测定川芎醇提物对5种食品中常见致病菌的最小抑菌浓度(MIC)与最小杀菌浓度(MBC)。具体操作如下:取11支洁净试管,依次标号,其中一号管为阴性对照管,2～9号管中各加入1 mL肉汤培养基,再将1 mL 100 g/L的川芎醇提物溶液加到2号管中,混匀后取1 mL加入到3号管中,依次进行二倍比稀释。

以观察阳性组呈现浑浊状,阴性组呈透明状为前提,若药物组试管中出现浑浊,说明有细菌生长(+),相反若试管内澄清透明,证明无菌生长(-),进一步结合药物组试管的浑浊度,判断抑菌药物的抑菌效果,越澄清,抑菌效果越好,其中肉眼观察出现浑浊前一试管的药物浓度记为MIC,并取出现浑浊试管中的菌液进行镜检,观察是否有菌存在。如药液有很深的色素,可重新接种后观察,若培养皿上无菌生长,说明药物具有杀菌的作用,无菌落出现的前一试管药物浓度记为MBC。

1.2.7 菌落生长曲线 菌落生长曲线参照Liu等[24]的方法并做部分修改。具体操作如下:分别取上述5种食源性致病菌原液10倍稀释后取15 μL,分别加入到15 mL肉汤培养基中,每种菌接种4管,每管加入100 μL不同浓度川芎醇提物(1/4 MIC、1/2 MIC、3/4 MIC),以同体积无菌水代替川芎醇提物为对照。将各试管置于37 ℃,120 r/min的摇床中培养,每隔2 h在无菌条件下取样,在660 nm波长处测定吸光度以反映微生物生长状态,绘制供试菌的生长曲线。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 川芎醇提物中活性成分含量

通过HPLC测定得川芎醇提物中TMP、阿魏酸含量分别为55.7、31.45 g/kg。福林酚法测得游离酚与结合酚的含量分别为177.38、42.86 g/kg。

2.2 川芎醇提物还原力及抗氧化能力测定

参照“1.2.3”测定方法,川芎醇提物稀释100倍后的还原力相当于14.79 μg/mL VC标准溶液的还原力。按照试剂盒测的川芎醇提物的总抗氧化能力为4.46 U/mg。川芎醇提物对羟自由基与超氧阴离子的抑制效果如图1所示。从图1(A、B)中可以看出,川芎醇提物对羟自由基的清除效果较超氧阴离子要好,其中川芎醇提物浓度在0.9 mg/mL时对超氧阴离子的清除率约为50%,即IC50约为0.9 mg/mL,与0.4 mg/mL VC的清除效果相当。同样,川芎醇提物对羟自由基的清除效果IC50约为0.75 mg/mL,此浓度条件下VC对羟自由基的清除率为84.56%,约为川芎醇提物的1.7倍。

图1 川芎醇提物对羟自由基(A)与超氧阴离子(B)的清除效果Fig.1 Clearance rate of Ligusticum chuanxiong extract on hydroxy radicals(A)and superoxide anion(B)

2.3 抑菌剂抗食源性致病菌的效果

试验中不同浓度的抑菌剂对5种食品中常见致病菌的抑制效果如表1和图2所示,其中阿莫西林作为阳性对照药物,对5种致病菌均有较好抑制作用,且对沙门氏菌的抑制效果最好,其抑菌圈最高能达到32.92 mm。125 g/L阿莫西林溶液对5种试验菌的抑制效果为:沙门氏菌>大肠杆菌>假单胞菌>金黄色葡萄球菌>枯草芽孢杆菌,且差异极显著(p<0.01)。等价浓度下,TMP与阿魏酸标品对5种试验菌的抑制效果比川芎醇提物弱,可能是由于其药物半衰期短引起的[25-26],刘亚杰[27]通过将TMP进行衍生化后,衍生化物的抗菌活性显著提高。川芎醇提物对5种试验菌的抑制效果为:沙门氏菌>大肠杆菌>假单胞菌>金黄色葡萄球菌>枯草芽孢杆菌,抑菌圈大小存在明显的浓度依赖性,此结果与高慧娟等[28]用75%的川芎醇提物对金黄葡萄球菌的抑制作用强于枯草芽孢杆菌结果一致。150 g/L与200 g/L 川芎醇提物对各试验菌间的抑制效果均呈极显著差异(p<0.01)。200 g/L 川芎醇提物对大肠杆菌的和沙门氏菌的抑制效果分别为125 g/L阿莫西林的80.68% 与76.85%。同样,从表1中可以发现,当川芎醇提物浓度为75 g/L时,其对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及假单胞菌的抑制效果均优于125 g/L阿莫西林。综上,川芎醇提物具有较好的抗菌活性,且对革兰氏阴性菌的抑制作用较革兰氏阳性菌的要强。100 g/L纯品TMP和阿魏酸的抗菌活性比川芎醇提物要弱,而川芎醇提物中这两种组分含量为55.7、31.45 g/kg,含量极低,考虑可能是川芎醇提物中酚酸类物质起到主要的抗菌作用,多组分之间也存在一定的协同效果[29],从而表现出较高的抗菌活性。

图2 川芎醇提物及阿莫西林对试验菌的抑菌效果Fig.2 Antibacterial effect of Ligusticum chuanxiong alcohol extract and amoxicillin on the test bacterials注:A～E依次为200 g/L川芎醇提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、 枯草杆菌、沙门氏菌及假单胞菌的抑制效果图,F为125 g/L阿莫西林对大肠杆菌的抑制效果图。

表1 不同抑菌剂对5种食源性致病菌的抑菌效果Table 1 Antimicrobial effects of different antimicrobial agents on 5 kinds of food-born pathogens

2.4 川芎醇提物抑制食品中致病菌的MIC与MBC测定

对上述5种食品中常见致病菌进行倍比稀释后测定MIC值,其MIC测定结果如表2所示,随着药液浓度的增加,菌液浑浊度呈下降趋势。取各试验组MIC管前一管进行镜检,镜检结果显示枯草杆菌与金黄色葡萄球菌呈现蓝紫色,其他3种呈现红色。

表2 川芎醇提物对5种食源性致病菌的最小抑菌浓度(g/L)Table 2 MIC of Ligusticum chuanxiong alcohol extract against the 5 food-born pathogens(g/L)

川芎醇提物对5种试验菌的MBC与MIC具体浓度如表3所示,整体的MIC介于6.25～25 g/L之间,MBC介于12.5～50 g/L之间。同时,从表3可以看出,川芎醇提物对沙门氏菌的敏感性最高,抑菌效果最好,结果与前面的敏感性结果一致。实验结果较唐杰等[15]用纸片扩散法测定75%的川芎醇提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及沙门氏菌的抑制效果要好,说明此试验方法中川芎醇提物提取有效成分含量更多,打孔法做抗菌实验效果更佳。

表3 5种食源性致病菌的MIC与MBC(g/L)Table 3 MIC and MBC of the 5 food-born pathogens(g/L)

图3 川芎醇提物对5种食源性致病菌生长曲线的影响Fig.3 Influence of Ligusticum chuanxiong alcohol extract on growth curve of 5 food-born pathogens注:A为大肠杆菌,B为金黄色葡萄球菌,C为枯草芽孢杆菌,D为沙门氏菌, E为铜绿假单胞菌。MIC为最小抑菌浓度,对照组不加抑菌剂。

2.5 川芎醇提物对革兰氏菌生长曲线的影响

川芎醇提物对5种革兰氏菌生长曲线的影响如图2所示,其中A～E分别为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、假单胞菌的生长曲线,各种菌随着时间的增长其吸光度值均呈上升趋势,与对照组相比,随着川芎醇提物浓度的提升,其吸光度度值均有下降。其中图A、D中在前6 h的吸光度增加的比较快,而往后则逐渐平缓,此时处于细菌生长的对数期,说明川芎醇提物在大肠杆菌与沙门氏菌的对数期对其有一定的抑制,肖悦等[30]发现川芎可以抑制葡萄糖基转移酶的活性,减少水不溶性葡聚糖的合成,本文的结果与此一致,沙门氏菌与大肠杆菌在对数期被抑制。图B、C、E中,前8 h检测的吸光度值较A、D都要低,细菌生长缓慢,菌落长时间处于迟缓期,川芎醇提物的添加改变了环境条件不利于革兰氏阳性菌生长,8 h细菌适应了生长环境,生长相对较快,最后趋向稳定。上述结果表明川芎醇提物对5种致病菌的生长影响不同,大肠杆菌与沙门氏菌对数期受抑制,其他三种革兰氏阳性菌的迟缓期被延长。

3 结论

川芎醇提物具有较强的抗氧化活性,存在浓度依赖性。对常见的食源性致病菌沙门氏菌、大肠杆菌、假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等具有较好的抑制效果,尤其是沙门氏菌、大肠杆菌,总体来说其对革兰氏阴性菌的抑制效果优于阳性菌。在格兰氏阴性菌对数期与格兰氏杨阳性菌的迟缓期作用效果尤为显著,MIC介于6.25～25 g/L之间,MBC介于12.5～50 g/L之间。等价浓度下川芎醇提物的抑菌效果优于纯品TMP和阿魏酸,可能是提取物中各组分之间存在一定协同作用。本文仅初步研究了川芎醇提物的抗氧化和抗菌活性,其抗菌机理及组分间的协同效应有待进一步研究。