β-防御素130在大肠杆菌中的串联表达、纯化及生物活性分析

蔺艳君，董彬



β-防御素130在大肠杆菌中的串联表达、纯化及生物活性分析

蔺艳君1,2，董彬1

1 滨州学院 生物与环境工程学院 山东省黄河三角洲野生植物资源开发利用工程技术研究中心，山东 滨州 256603 2 滨州学院 艺术学院，山东 滨州 256603

为了研究抗菌肽β-防御素130的生物学活性和实现大规模制备，通过改良其分子结构，构建表达载体pET28a-3×β-defensin130，利用大肠杆菌BL21 (DE3) 作为宿主细胞诱导表达后为水溶性蛋白。对纯化后抗菌肽进行抑菌实验、稳定性实验、MTT实验和溶血性实验确定其生物活性。最终成功制备出25 kDa的重组蛋白，对金黄色葡萄球菌 (ATCC 25923)(45 μg/mL) 和单增李斯特菌 (ATCC 221633) (80 μg/mL) 等革兰氏阴性和阳性菌都表现出极强的抗菌活性，且其抗菌活性不受温度、pH值和蛋白酶消化等影响，MTT细胞毒性实验显示其对HEK293细胞无毒性且对兔源红细胞具有极低的溶血性。这将为新型抗菌肽的开发提供理论基础并推动抗生素替代产业快速发展。

防御素，抗菌肽，原核表达，蛋白纯化，抗菌活性

抗生素滥用导致的耐药性目前已成为一个严重的公共健康问题，近年来，“超级细菌”等事件的发生更显示出这一问题的严重性。因此，寻找和开发新型高效抗生素替代品将是解决这一问题的必然选择。抗菌肽 (Antimicrobial peptides，AMPs) 是一类具有广谱抗菌性，能抗真菌、病毒、寄生虫、革兰氏阳性和阴性菌的小分子多肽类物质，其最受瞩目的特性是不易产生耐药性[1-4]。目前，已从哺乳动物、植物、无脊椎动物等不同物种中鉴定出2 800多个AMPs，其中大多数AMPs含有5–100个氨基酸[5]。防御素是富含半胱氨酸的一类阳离子多肽，主要包含α、β和θ这3个亚基家族。大多数防御素包含18–50个氨基酸，在免疫系统抵御外来感染侵略过程中发挥着重要作用。目前，通过计算机搜寻策略鉴别出的β-防御素人源编码基因有28个。β-防御素130于2014年发现[6]，在人源巨噬细胞中表达，已经证实在巨噬细胞消除疟原虫抵抗疟疾的过程中有重要作用。由于在巨噬细胞中的含量较低，提取和纯化难度较大，无法进行大规模制备，导致对β-防御素130的制备和功能研究报道不多。

目前，为了改善抗菌肽的抗菌功能，常利用不同来源的宿主细胞进行蛋白的重组表达，例如大肠杆菌、毕赤酵母和莱茵衣藻等[7-9]。除此之外，将抗菌肽进行串联表达也是提高抗菌肽活性的一种策略。Fuquan Hu实验室[10]成功将8个hPAB-β在大肠杆菌中实现串联表达，我们在之前的研究[9]中，利用莱茵衣藻成功表达了3个拷贝的Mytichitin-A，结果均显示串联抗菌肽具有更好的抗菌效果和抗菌谱。

与传统的提取分离方法相比，基因工程法是一种高效的大规模生产方法，大肠杆菌具有DNA操作简单、培养成本低、表达量高、生产时间短等优点，有利于蛋白质表达等优势。在本研究中，选用大肠杆菌作为宿主细胞，表达含有3拷贝的β-防御素130 DNA编码序列。随后，用Ni柱进行亲和纯化，分析其抗菌活性、溶血活性、细胞毒性和稳定性。为新型抗菌肽的开发提供理论基础并推动抗生素替代产业快速发展。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、细胞和质粒

大肠杆菌XL1-blue、BL21 (DE3) 感受态细胞、HEK293细胞和pET28a质粒均为本实验室保存。

1.1.2 主要试剂

限制性内切酶、DNA连接酶、DNA分子量marker和蛋白marker等均购自美国Thermo Fisher公司；Ni SepharoseTM6 Fast Flow蛋白纯化介质购自美国GE Healthcare公司；NC膜购自北京索来宝公司；His抗体购自美国Sigma-Aldrich公司，HRP标记的羊抗兔抗体购自北京康为世纪公司。木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶购自北京索莱宝公司。其他常规试剂均购自北京索来宝公司。

1.1.3 仪器

超声波细胞破碎仪 (宁波新芝，JY98-IIIDN)；恒温摇床 (天津欧诺，JNY-110B)；核酸微量测定仪 (德国Eppendorf，BioSpectrometer D30)；琼脂糖水平电泳仪 (北京六一，DYCP-32B)；台式高速离心机 (德国Eppendorf，5424)；高速冷冻离心机 (美国Thermo Fisher, Sorvall ST8R)；蛋白垂直电泳仪、蛋白转膜仪 (北京六一，DYCZ-24KF、DYCZ-40K)；凝胶成像仪 (上海勤翔，GenoSens 1860)；酶标仪 (南京德铁，HBS-1096A)。

1.2 方法

1.2.1pET28a-3×β-防御素130载体构建

β-防御素130的编码基因序列为ATGTATCG CTCTTAAAGGCGTCTGCCGTGATAAGCTCTGTAGTACTCTAGACGATACCATAGGGATATGTAATGAAGGTAAAAAGTGCTGTAGAAGGTGGTGGATTCTGGAACCCTATCCAACCCCGGTCCCAAAAGGTAAGAGCCCTGGTACCGGTGTTATTCCTGGCCA，3×β-防御素130的编码序列为3个β-防御素130直接串联组成，由苏州金维智公司合成并克隆至pUC57载体上，通过RⅠ和Ⅰ两个酶切位点对其进行双酶切，获得目的基因。对pET28a载体使用同样的内切酶进行双酶切，回收后与目的基因连接，并采用化学转化法转入XL1-blue感受态细胞，随后从平板中挑取阳性菌落进行培养，抽提质粒，测序验证。

1.2.2 融合蛋白的表达与优化

IPTG诱导浓度的条件优化：挑取含有pET- 28a-3×β-defensin130载体的大肠杆菌BL21(DE3)单克隆菌落，在含卡那霉素 (120 μg/mL) 的100 mL LB培养基中37 ℃、200 r/min过夜培养 (12 h)。将50 mL过夜培养物接种于1 L培养基中，于37 ℃、200 r/min培养。当600值达到0.6时，将培养温度降至16 ℃，同时加入不同浓度 (0.05– 1.2 mmol/L) 的IPTG诱导剂，连续培养16 h。随后，12 000 r/min、4 ℃离心10 min，收集菌体进行超声破碎。以未诱导的含pET28a(+)载体的大肠杆菌BL21 (DE3) 作为蛋白表达的载体对照，进行SDS-PAGE分析。IPTG诱导时间的条件优化：挑取含有pET-28a-3×β-防御素130载体的大肠杆菌BL21(DE3)单克隆菌落，在含卡那霉素(120 μg/mL) 的100 mL LB培养基中37 ℃、200 r/min过夜培养 (12 h)。将50 mL过夜培养物接种于1 L培养基中，于37 ℃、200 r/min培养。当600值达到0.6时，将培养温度降至16 ℃，同时加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导剂，连续培养，每2 h取一次样。随后，12 000 r/min、4 ℃离心10 min，收集菌体进行超声破碎。以未诱导的含pET28a(+)载体的大肠杆菌BL21 (DE3) 作为蛋白表达的载体对照，进行SDS-PAGE分析。

1.2.3 融合蛋白的亲和纯化

将1 L诱导表达后的菌体重新悬浮于20 mL的裂解缓冲液中 (50 mmol/L Hepes，0.5 mol/L NaCl，5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L PMSF，10%甘油，20 mmol/L咪唑，4 mmol/L β-巯基乙醇， 1 mg/mL溶菌酶，pH 7.4)，冰上孵育20 min，超声破碎后4 ℃、12 000 r/min离心10 min，吸出上清液，加入预先使用裂解液平衡好的Ni-NTA蛋白纯化柱在4 ℃下结合6 h，结合完毕后流出结合液，用3倍柱体积的裂解液漂洗3遍，最后用含500 mmol/L咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，然后进行透析除去咪唑，最后超滤管离心浓缩获得目的蛋白，使用Brandford法测定蛋白浓度。

1.2.4 SDS-PAGE和Western blotting分析

将定量的蛋白样品与2×SDS-PAGE上样缓冲液以1∶1的比例混合，煮沸10 min。在15%的SDS-PAGE凝胶上进行分离，每孔上样20 μg蛋白，电泳条件为150 V、1.5 h，进行考马斯亮蓝染色或电转移至0.45 μm的硝酸纤维素膜进行免疫印迹分析。使用5%脱脂奶粉封闭印迹膜1 h，然后用抗His抗体 (1∶2 000) 孵育1 h。将印迹膜用TBST洗涤3次，加入含HRP偶联的山羊抗兔二抗 (1∶5 000) 的封闭液再孵育1 h。使用TBST洗涤3次之后，使用ECL显色液进行显影，扫膜仪拍照[11]。

1.2.5 最小抑菌浓度测定

以PBS作为对照组，使用PBS稀释3×β-防御素130 (10–120 μg/mL)，96孔板每孔加入20 μL稀释液。受试细菌培养至浓度为2×105–7×105CFU/mL，每孔100 μL菌悬液加入96孔板。然后37 ℃、220 r/min培养12 h，最后使用酶标仪测定600。所有试验均独立重复进行3次[12]。

1.2.6 抑菌圈测定

首先，从平板中挑取受试菌落于含有5 mL LB培养基的15 mL试管，在37 ℃、220 r/min条件下培养。当浓度达到2×105CFU/mL时，取500 μL的细胞液涂布在LB平板上。使用8 mm打孔器打孔，将纯化的3×β-防御素130分别在4 ℃、25 ℃、37 ℃、65 ℃、90 ℃下孵育1 h，然后加入孔中，孵育12–24 h，观察平板抑菌圈大小。测定pH值耐受实验时，将纯化的3×β-防御素130干粉分别使用pH值为2、4、6、8、10的溶液进行溶解，加入平板孔中，孵育12–24 h，观察平板抑菌圈大小。测定蛋白酶耐受实验时将纯化的3×β-防御素130分别用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶在37 ℃下处理1 h，随后加入平板孔中，孵育12–24 h，观察平板抑菌圈大小。所有试验均独立重复进行3次[13]。

1.2.7 MTT法

HEK293细胞作为候选细胞系，将不同浓度的3×β-防御素130 (0、20、40、60、80、100、120、140、160 μg/mL) 与HEK293细胞在96孔板中孵育72 h，然后向每孔中加入20 μL甲基噻唑四唑(MTT，5 mg/mL)，在37 ℃下再孵育4 h。在该板上加入二甲基亚砜 (DMSO)，以溶解蓝紫色的甲瓒晶体。最后，用酶标仪测量570 nm的吸光度。用标准公式计算细胞存活率(%)=3×β-防御素130 处理的吸光度/对照细胞的吸光度×100%。所有试验均独立重复进行3次。

1.2.8 溶血性试验

将新西兰白兔全血样品置于含K2EDTA的离心管中，1 000 r/min离心5 min，除去血浆。用1×PBS洗涤3次，调整红细胞浓度为4%。将90 μL的红细胞与10 μL的3×β-防御素130混合，37 ℃再孵育30 min，1 500 r/min离心10 min，测定上清液在540 nm处的吸光值。分别用1×PBS和1%的Triton X-100作为0%和100%溶血对照。

2 结果与分析

2.1 pET28a-3×β-防御素130载体的构建

β-防御素130由171 bp的核苷酸序列编码，串联重复序列由3个拷贝的编码序列组成，将合成的3×β-防御素130编码序列分别插入到pET28a(+)载体中，RⅠ和Ⅰ位点分别位于5′端和3′端。图1是N-末端含有6×His标签的pET28a-3×β-defensin130载体示意图。

2.2 3×β-防御素130的表达与优化

IPTG诱导剂优化结果如图2A所示，在诱导细胞中按预期表达了25 kDa蛋白，根据条带灰度，不同浓度的IPTG诱导的表达水平没有差异(图2A)。为了优化诱导时间，自IPTG加入到0.5 mmol/L的最终浓度后，每2 h收集培养细胞。将8 h 诱导细胞的表达水平设为100%时，10、12、14、16 h内3×β-防御素130的表达量分别为330%、328%、327%和332% (图2B)。以上结果表明，在16 ℃条件下表达3×β-防御素130的最佳培养条件是0.5 mmol/L IPTG诱导表达12 h。

图1 载体元件示意图

图2 3×β-防御素130的表达及培养条件优化

2.3 3×β-防御素130的纯化及Western blotting分析

为了确定重组蛋白的水溶性，我们用最佳培养条件培养细胞。如图3A所示，重组3×β-防御素130在大肠杆菌中以可溶性形式表达，Western blotting证实了3×β-防御素130的特异性 (图3B)。亲和纯化后的蛋白使用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色以及Western blotting分析，得到25 kDa 3×β-防御素130 (图3C–D)。

2.4 3×β-防御素130抗菌谱的测定

用最小抑菌浓度法测定3×β-防御素130的抗菌谱，结果见表1。重组3×β-防御素130对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有抑菌活性，对金黄色葡萄球菌抑菌浓度最低 (ATCC 25923) 为45 μg/mL，对枯草芽孢杆菌 (AHU 1035) 和单增李斯特菌 (ATCC 21633) 的最小抑菌浓度分别为50 μg/mL和80 μg/mL。对革兰氏阴性菌大肠杆菌O157 (ATCC 35150)、肠炎杆菌 (ATCC 10467) 和绿脓杆菌 (ATCC 27853) 的最小抑菌浓度分别为60、55、50 μg/mL。

图3 3×β-防御素130的纯化及Western blotting分析

表1 纯化后的重组3×β-防御素130抗菌谱

2.5 3×β-防御素130对温度、pH值和蛋白酶消化的耐受性

选用金黄色葡萄球菌 (ATCC 25923) (40 μg/mL) 对3×β-防御素130进行抑菌耐受活性分析。3×β-防御素130经不同温度(4 ℃、25 ℃、37 ℃、65 ℃、90 ℃) 处理后，抑菌活性无明显变化 (图4A)。如图4B所示，pH值并未影响3×β-防御素130的生物活性，经不同pH值 (2、4、6、8、10) 处理的3×β-防御素130，其抑菌效果没有差异。为了分析蛋白酶对3×β-防御素130生物活性的影响，采用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶处理3×β-防御素130。结果表明，3×β-防御素130对蛋白酶消化具有一定耐受性，其抑菌作用不受影响 (图4C)。

图4 3×β-防御素130对温度、pH值和蛋白酶消化的耐受性分析

2.6 3×β-防御素130的细胞毒性及溶血性

与对照组相比，重组3×β-防御素130并未改变HEK293细胞的存活率，表明3×β-防御素130在20–120 μg/mL浓度下没有细胞毒性 (图5A)。此外，纯化的3×β-防御素130加入0–120 μg/mL重组3×β-防御素130后，对兔红细胞无溶血性 (图5B)。当蛋白浓度分别为160 μg/mL和200 μg/mL时，溶血活性分别小于0.8%和1.6%，表明3×β-防御素130几乎不具有溶血性。

3 讨论

将3×β-防御素130构建至表达载体pET28a上，其中T7作为启动子启动转录，T7-Ter作为终止子终止转录。结果表明，3×β-防御素130在中的分子量为25 kDa。从哺乳动物细胞中提取β-防御素130是一种高成本、低效率的生产方法。鉴于其制备效率低下，我们采用原核生物大肠杆菌作为细胞工厂用于大规模生产重组β-防御素130。重组3×β-防御素130在大肠杆菌中成功表达且为可溶性蛋白，并且我们优化了IPTG浓度和诱导时间等培养条件。许多利用大肠杆菌重组表达的抗菌肽，如杂合AL32-P113[14]和HG31-P-113[15]，通过优化培养条件，均成功表达并且提高了产量和抗菌活性。这些结果表明大肠杆菌可能是制备3×β-防御素130的合适宿主。大肠杆菌的遗传背景清楚、生长速度快、培养成本低，蛋白表达效率同毕赤酵母和哺乳动物细胞相比可以高出好几倍，同时所获得大多数蛋白的活性较高，稳定性也较好。从大肠杆菌表达的3×β-防御素130抗菌活性测试中可以看出，其对革兰氏阴性和阳性菌均表现出较强的抗菌活性和稳定性。这些进一步证明抗菌肽的串联表达也是提高抗菌肽活性的一种有效策略。

为了进一步探讨3×β-防御素130在不同环境条件下的应用，对3×β-防御素130进行了极端pH变化、热处理和蛋白酶消化试验。结果表明，在pH变化和热处理的不同培养条件下，3×β-防御素130的抗菌活性不受影响。此外，本实验研究了3×β-防御素130对木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶的抗性。结果表明，3×β-防御素130具有作为商业抗生素替代品和食品防腐剂的潜力。溶血试验表明，当浓度低于120 μg/mL时，3×β-防御素130对兔红细胞无溶血活性，当浓度分别为160 μg/mL和200 μg/mL时，3×β-防御素130对兔红细胞的溶血活性分别小于0.8%和1.6%，表明3×β-防御素130对兔红细胞无溶血活性。相比之下，当蛋白浓度为100 μg/mL时[14]，有报道的混合肽L31-P113和AL32-P113的溶血活性超过1.8%。当蛋白浓度为128 μg/mL时[16]，LH28的溶血性为35%。这些结果表明，与其他抗菌肽相比，3×β-防御素130具有较低的溶血活性。此外，大肠杆菌表达的3×β-防御素130对HEK293细胞没有毒性，因此3×β-防御素130是一种安全的抗生素替代品。

在本实验中，使用6×His作为蛋白标签进行抗菌肽的重组表达，分子量较小，对蛋白结构和功能影响不大，便于纯化，是目前应用最多的标签，且已有大量抗菌肽以6×His作为标签在大肠杆菌和毕赤酵母中进行表达且不影响生物活性。另外，利用大肠杆菌进行蛋白表达有可能因蛋白错误折叠导致以水不溶的包涵体形式存在于细胞中，越来越多的融合标签被开发应用于蛋白的促溶，如MBP和GST标签等。本实验中的串联抗菌肽未出现包涵体，可能是由于抗菌肽结构相对简单容易折叠形成水溶性蛋白。

综上所述，β-防御素130在大肠杆菌中作为一种可溶性蛋白成功表达，并对常见的革兰氏阳性菌和阴性菌具有较强的抗菌活性，且其抗菌活性不受温度、pH值和蛋白酶消化的影响。此外，大肠杆菌中表达的3×β-防御素130对HEK293细胞没有显示毒性，并且显示出相对低的溶血活性。

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Tandem expression, purification and biological activity of recombinant multimeric β-defensin130 in

Yanjun Lin1,2, and Bin Dong1

1 Shandong Provincial Engineering and Technology Research Center for Wild Plant Resources Development and Application of Yellow River Delta, College of Biological and Environmental Engineering, Binzhou University, Binzhou 256603, Shandong, China 2 College of Art and Design, Binzhou University, Binzhou 256603, Shandong, China

To improve and broaden the antimicrobial activity of β-defensin130, 3 copies of β-defensin130 encoding sequences were synthesized and cloned into pET28a (+) expression vector, and expressed inBL21 (DE3) as a 25 kDa soluble protein. The affinity purified 3×β-defensin 130 displayed antimicrobial activity against not onlyGram-positive strains including(ATCC 25923) (45 μg/mL) and(ATCC 221633) (80 μg/mL) but also Gram-negative strains. Furthermore, the antimicrobial activity of β-defensin130 was not affected by temperature, pH and proteinase digestion. In addition,-derived 3×β-defensin130 was not toxic to HEK 293 cells and showed a relatively low hemolytic activity against rabbit erythrocytes. Our study proves 3×β-defensin130 expressed inis stable, non-cytotoxic and low-hemolytic active with great potential as alternative antibiotics.

defensin, antimicrobial peptide, prokaryotic expression, protein purification, antimicrobial activity

November 28, 2018;

April 18, 2019

Natural Science Foundation of Shandong Province (No. ZR2018PC010), the Doctor Foundation of Binzhou University (No. 2018Y09), Natural Science Program of Binzhou University (No. BZXYG1811).

Bin Dong. Tel: +86-543-3190042; E-mail:dongbin@bzu.edu.cn

山东省自然科学基金 (No. ZR2018PC010)，滨州学院博士科研启动费项目 (No. 2018Y09)，滨州学院科研项目 (No. BZXYG1811)资助。

10.13345/j.cjb.180492

蔺艳君, 董彬. β-防御素130在大肠杆菌中的串联表达、纯化及生物活性分析. 生物工程学报, 2019, 35(6): 1088–1096.

Lin YJ, Dong B. Tandem expression, purification and biological activity of recombinant multimeric β-defensin130 in. Chin J Biotech, 2019, 35(6): 1088–1096.

(本文责编 郝丽芳)