ELISA与NAT检测在血液HBV筛查中的关系研究

钱江 蔡隽 华重千 牛鸿婧

全球每年有近百万人因输入不健康血液或血液制品而感染病毒性肝炎等输血传播性疾病，已约有4亿人感染了慢性乙型肝炎，HBV感染已成为世界性的公共卫生问题[1]。国人HBsAg阳性率约为9.8%，HBV感染率约为59.3%，超过1.3亿人为HBV携带者，约8亿多人感染了HBV[2]。人体感染HBV后容易引发肝炎、肝硬化，甚至发展成肝癌，严重威胁生命安全。为降低输血传播HBV的发生率，采供血机构常采用2种不同厂家生产的ELISA试剂对献血者血液标本进行HBsAg检测。但由于HBV检测窗口期长、临床变异株多以及免疫沉默现象等的局限，ELISA检测仍然存在一定程度的漏检。病毒核酸扩增（NAT）技术基于直接检测HBV核酸的原理，在人体感染HBV后数天内就能检出血液标本中极其微量的病毒DNA，可大幅缩短病毒检测窗口期[3-4]，降低HBV漏检的发生率。基于此，本研究通过分析ELISA与NAT检测血液HBV的符合率，探讨这2种方法在血液HBV筛查中的关系，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 血液标本 选取金华市中心血站2017年6月至2018年6月经采血现场快速初筛合格的献血者血液标本共59 483份，所有献血者均符合《献血者健康检查要求》的规定。按照《血站技术操作规程2015》的要求，在采血结束后立即依次用3支采血管留取相应血液标本，第1支为带分离胶的促凝管（EDTA－K2促凝、5ml）用于血清学检测；第2支为带分离胶的的真空采血管（EDTA－K2抗凝、8ml）用于核酸检测；第3支为无分离胶的抗凝管（EDTA-K2抗凝、5ml）用于血型、ALT的检测。血液采集后4h内离心分离红细胞和血浆，置于2～8℃环境保存，72h内完成血液核酸检测。

1.2 试剂 HBsAg ELISA检测国产试剂（厦门新创，批号：2107015103、2017045109等），进口试剂（法国伯乐，批号：6M0223、7A0226等）。HBV DNA NAT检测试剂（美国罗氏 Cobas TaqScreen MPX 2.0 test，批号：215559、235646等）。

1.3 仪器设备 Xantus150全自动酶免加样仪（深圳爱康公司），Fame24/20全自动酶免分析仪（瑞士HAMILTON公司），Microlab Star全自动混样仪（瑞士HAMILTON公司），COBAS@AmpliPrep全自动核酸提取纯化仪（美国罗氏公司），COBAS@TaqMan全自动医用PCR分析系统（美国罗氏公司）。

1.4 检测方法

1.4.1 ELISA检测 采用Xantus150全自动酶免加样仪将血液标本分配至各检测项目的微板上，用Fame24/20全自动酶免分析仪对其进行加酶、孵育、洗板、显色，用血站实验室信息管理系统判读结果。2种ELISA试剂检测HBsAg结果均呈反应性则判为双试剂阳性；2种试剂检测结果均呈无反应性则判为阴性；单试剂初筛结果呈反应性，双孔复检后结果呈反应性则判为单试剂阳性，否则为阴性。ELISA检测阳性包括ELISA检测双试剂阳性与单试剂阳性。

1.4.2 NAT检测 先采用Microlab Star全自动混样仪对ELISA检测阴性和单试剂阳性的标本进行6人份HBV DNA的混样检测，再用COBAS@AmpliPrep全自动核酸提取纯化仪对混样样本进行核酸的提取和纯化，最后用COBAS@TaqMan全自动医用PCR分析系统检测HBV DNA扩增后的靶序列，在PDM服务器中自动判读结果。混样检测结果呈无反应性则判定为6个标本HBV DNA检测阴性。混样检测结果呈反应性则进行拆分检测，拆分检测呈无反应性则判定HBV DNA检测阴性；若拆分检测结果呈反应性则判定该标本HBV DNA检测阳性。ELISA检测双试剂阳性标本直接进行单人份HBV DNA检测，检测结果呈无反应性则判定HBV DNA检测阴性，检测结果呈反应性则判定HBV DNA检测阳性。

1.5 观察指标 （1）ELISA与NAT检测血液HBV的结果；（2）ELISA 与 NAT 检测血液 HBV 的符合率；（3）ELISA与NAT检测血液HBV的标本吸光度与临界值的比值（S/CO值）分布情况，S/CO值反映出NAT检测对不同浓度HBV DNA的检测能力。

2 结果

2.1 ELISA与NAT检测血液HBV结果59 483例血液标本中ELISA检测双试剂阳性NAT检测阳性的标本25例，ELISA检测单试剂阳性NAT检测阳性的标本30例，ELISA检测阴性NAT检测阳性120例，ELISA检测双试剂阳性NAT检测阴性的标本6例，ELISA检测单试剂阳性NAT检测阴性的标本38例，ELISA与NAT检测阴性的标本59 264例，见表1。

表1 59483例血液标本ELISA与NAT检测HBV结果[例（%）]

2.2 ELISA与NAT检测血液HBV的符合率 ELISA检测双试剂阳性标本31例，其中NAT检测阳性25例，两者符合率为80.6%；ELISA检测单试剂阳性68例，其中NAT检测阳性30例，两者符合率为44.1%；ELISA检测阳性共99例，其中NAT检测阳性共55例，ELISA与NAT检测血液HBV的符合率为55.5%。

2.3 ELISA与NAT检测血液HBV的S/CO值分布情况 ELISA检测双试剂阳性NAT检测阳性标本共25例，其中S/CO值＜2为1例，2≤S/CO值＜5为1例，S/CO值≥5为23例；ELISA检测单试剂阳性NAT检测阳性标本共30例，其中S/CO值＜2为14例，2≤S/CO值＜5为11例，S/CO值≥5为5例；ELISA检测单试剂阳性NAT检测阴性标本共38例，其中S/CO值＜2为24例，2≤S/CO值＜5为11例，S/CO值≥5为3例；见表2。

表2 ELISA与NAT检测血液HBV的S/CO值分布情况[例（%）]

3 讨论

输血作为一种重要的治疗方法已广泛应用于临床，但输血也存在传播各类病毒的风险，对患者造成严重的危害，因此输血安全问题已成为全球关注的焦点。随着ELISA检测试剂灵敏度、特异度的大幅提升，输血传播性疾病的发生风险已大幅降低，但由于存在检测窗口期，ELISA检测无法从根本上杜绝其发生。据统计，超过90%HBV、HIV和75%以上的HCV的输血传播感染均来源于病毒窗口期，NAT检测可直接检测病毒微量核酸，将窗口期分别从原来的50、72、22d缩短至25、59、11d[5]，是一种理想的检测技术。

本研究通过对金华市中心血站59 483例血清标本进行ELISA与NAT检测HBV，检出ELISA检测阳性NAT检测阳性标本55例，ELISA检测阳性NAT检测阴性标本44例，因未进行追踪确认，无法判断是NAT漏检或是ELISA检测假阳性，也无法对其真实的血清学状态进行判断。分析造成ELISA检测阳性NAT检测阴性的原因，可能是由于献血者体内携带HBV，因处于血清学转换期，HBV载量过低，NAT无法直接检测到病毒DNA，但可以通过ELISA检测到HBsAg，故ELISA检测对处于血清转换期的HBV携带者具有较好的排查作用。ELISA检测阴性NAT检测阳性标本高达120例，通过NAT检测弥补ELISA不能直接检测病毒核酸的方法学缺陷，可有效避免携带HBV的血液制品用于临床。有研究报道称，若采用国产ELISA试剂与NAT联检，献血人群中HBV漏检率约为16/10万；若采用进口ELISA试剂与NAT联检，献血人群中HBV漏检率约为1.6/10万[6]。国产试剂的ELISA漏检率比进口试剂大10倍，进口ELISA试剂的检测灵敏度明显优于国产试剂，因此血站检验科可以选择或保持进口ELISA试剂与NAT联检的方式对献血者血清标本进行血液HBV筛查，以提高准确度。

本研究ELISA检测双试剂阳性NAT检测阳性25例，ELISA检测双试剂阳性NAT检测阴性6例，两者符合率为80.6%，这与张琼等[7]报道相似，NAT有部分漏检的情况也基本与国内外报道相符[8-11]。ELISA检测单试剂阳性68例，其中NAT检测阳性30例，两者符合率仅为44.1%，明显低于ELISA检测双试剂阳性NAT阳性的符合率。由于ELISA检测各环节中的不可控因素较多，单试剂检测阳性的标本中会存在高比例的假阳性[12]，是导致符合率较低的原因之一。观察S/CO值分布情况可知，ELISA检测双试剂阳性NAT检测阳性标本中S/CO值≥5比例为92.0%；而ELISA检测单试剂阳性NAT检测阳性标本中S/CO值≥5比例仅为16.6%，NAT对不同载量乙肝病毒检测能力的差异造成了两者符合率的不同。

NAT检测是以HBV DNA为检测对象，可以大大缩短抗体检测窗口期。目前，很多未开展NAT检测的血站仍然采用ELISA检测方法对HBsAg进行检测，由于HBV病毒载量低，这样做容易使处于血清转换期的HBV漏检，NAT检测技术正好弥补了这一缺陷[13-14]，可降低隐匿性乙型肝炎的发生率。在HBV疫苗接种、抗病毒药物使用、抗病毒治疗的过程中，由于病毒变异，HBsAg的合成降低、结构改变，病毒复制受限，均会造成HBV在ELISA检测中漏检，而NAT检测则不受此类因素的制约。

综上所述，ELISA与NAT检测在血液HBV筛查中各具优势、各有利弊，2种检测方法不能相互取代，只能互为补充。本血站现行的ELISA与NAT相结合的检测模式是目前采供血机构降低HBV输血传播发生风险比较理想的一种检测模式，对保障血液安全起着重要的作用。