METTL3在结直肠癌组织中的表达及其临床意义

黄忠炎 王剑飞 孙金杰 田洋洋

结直肠癌是目前常见的恶性肿瘤，同时也是高致死率的恶性疾病之一，严重威胁国民健康。尽管结直肠癌诊治技术近年来迅速发展，化疗方案不断更新，但结直肠癌的长期生存情况仍然较差，研究结直肠癌诊断、预后评价以及与其临床特征相关的分子标志物仍具有重大意义[1-2]。

N6-甲基腺苷（M6A）是mRNAs和lncRNAs最常见的修饰方式。M6A修饰主要发生在RACH序列中的腺嘌呤上（R=G或A；H=A、C或U）并参与了RNA的稳定性、定位、剪接和翻译的调节[3-5]。M6A可影响多种生物学过程，包括发育、免疫、DNA损伤反应、肿瘤形成和转移、干细胞更新、生物节律、细胞分化及细胞周期等[6-7]。M6A的修饰是通过甲基转移酶样蛋白3（METTL3）、甲基转移酶样 14（METTL14）和 Wilms肿瘤相关蛋白（WTAP）实现的[8-9]。目前证实METTL3是促进肿瘤进展的重要因素[10]，但对结直肠癌METTL3是否可作为结局预判的指标报道不多，故我们收集67例结直肠癌患者的病理组织标本进行研究，观察METTL3 mRNA和蛋白在结直肠癌中的表达情况，探讨其与患者生存时间及临床病理指标之间的关系，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2013年4月至2017年12月在本院接受结直肠癌根治术的67例患者作为研究对象，其中男性 29例，女 38例，年龄 18～70（59.03±12.84）岁；瘤径＜5cm者35例，＞5cm者32例；肿瘤组织分化好者19例，分化差者48例；存在远处转移者23例，未转移者44例；存在淋巴结转移者39例，未转移者28例；肿瘤侵袭深度达T1、T2水平共18例，T3、T4水平共49例。收集术中切除的结直肠癌组织及配对癌旁正常组织标本，以及24例肝转移组织标本。所有患者术前未接受过放化疗，组织标本的使用取得患者或家属的知情同意。本研究经本院伦理委员会审查通过。本研究所采用的RT-PCR及免疫组化技术检测均委托杭州亿徕生物科技有限公司进行。

1.2 方法

1.2.1 METTL3 mRNA 检测采用RT-PCR技术。原位肿瘤组织、正常组织及肝转移组织通过液氮碾碎后经Trizol法提取RNA。通过TAKARA逆转录试剂盒（日本宝日医生物科技公司产品）合成cDNA，再通过一步法SYBR荧光定量试剂盒（北京全式金生物科技公司产品）于PCR仪（美国罗氏公司产品）进行定量检测和分析。所有定量结果与GADPH相比较。所有引物购自于杭州亿徕生物科技有限公司。引物如下：METTL3 forward，50-TTGTCTCCAACCTTCCGTAGT-3′;METTL3 reverse，50-CCAGATCAGAGAGGTGGTGTAG-3′；GAPDHforward，50-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′；GAPDHreverse，50-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。

1.2.2 METTL3蛋白 检测采用免疫组化技术。对获得的组织进行石蜡包埋，同时切成4μm每张行免疫组化染色，应用En Vision法通过自动免疫组化染色机器（Dako，丹麦）进行染色，病理结果由2位高年资病理科医师进行判定。鼠抗人METTL3蛋白单克隆抗体为美国Abcam公司产品，En Vsion免疫组化试剂盒为丹麦Dako公司产品。METTL3的染色定位在核上，以细胞核被染成棕黄色者为阳性细胞。根据阳性细胞百分比评分：0%为0分；1%～25%为1分；26%～50%为2分；51%～75%为3分；＞75%为4分。染色深度评分：0分为没有染色；1分为弱染色；2分为中度染色；3分为强染色。

1.3 统计学处理 采用SPSS17统计软件，计量资料以表示，组间比较采用t检验；计数资料组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson法；采用ROC曲线法计算METTL3 mRNA相对表达量的截断值。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，计算METTL3 mRNA高表达与低表达患者的生存时间，并采用log-rank法比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 METTL3 mRNA在正常组织、肿瘤组织及肝转移组织中的表达情况 见图1。

图1 METTL3 mRNA在肿瘤组织及肝转移组织中的表达情况（*P＜0.05）

由图1可见，与正常组织比较，METTL3 mRNA在肿瘤组织及肝转移组织中存在高表达（P＜0.05）。结直肠肿瘤Ⅰ/Ⅱ期患者中METTL3 mRNA的表达也是低于Ⅲ/Ⅳ期患者（P＞0.05）。通过ROC曲线计算得METTL3 mRNA相对表达量的截断值为2.85。METTL3 mRNA相对表达量高于2.85视为高表达，反之视为低表达。

2.2 METTL3蛋白在正常组织、肿瘤组织及及淋巴结转移组织中的表达情况 见图2。

由图2可见，METTL3蛋白在肿瘤组织中存在明显的中强染色，在正常组织中存在弱染色，且阳性细胞比例远低于肿瘤组织中。

2.3 METTL3 mRNA的表达与临床病理因素的相关性见表1。

由表1可见，METTL3 mRNA的表达与淋巴结转移存在显著相关性（P＜0.01），但是其与年龄、性别、肿瘤大小、组织分化程度、远处转移及侵袭深度无明显的相关性。

图2 METTL3蛋白在正常组织、肿瘤组织及及淋巴结转移组织中的表达情况（免疫组化染色，×400）

表1 METTL3mRNA的表达与临床病理因素的相关性[例（%）]

2.4 METTL3 mRNA的表达与结直肠癌患者生存预后的关系 见图3。

由图3可见，METTL3 mRNA高表达与低表达患者的中位生存时间分别为23个月与43个月，在随访的4年时间中METTL3 mRNA低表达患者的生存率为41.2%，明显高于METTL3 mRNA高表达者的24.2%，差异有统计学意义（P＜0.01）。

图3METTL3mRNA高表达与低表达患者生存曲线

3 讨论

METTL3作为mRNA甲基转移酶，参与mRNA的生成和剪切调控进而促使癌基因的翻译介导了肿瘤进展，并且这种化学修饰是可逆的，广泛存在于真核生物体内[4]。已有的研究证实METTL3在人肝细胞癌（HCC）中表达上调并预测不良预后，通过实验证实敲除METTL3可在体外抑制肝癌细胞增殖和迁移，同时在体内抑制肝癌成瘤性和肺转移[11]。然而，在另一项研究中，METTL3被认为是肾癌的抑癌基因，抑制肿瘤的增殖、迁移和细胞周期[12]，这些结果表明，METTL3可能在不同分化肿瘤中起相反的作用，这可能是由于肿瘤微环境的复杂性和肿瘤高度异质性所致。同时这也与METLL3参与肿瘤的作用机制密不可分。METTL3在肿瘤中的作用机制可分为两种模式：M6A依赖性和M6A非依赖性。例如，在肝癌中敲除METTL3可以减少M6A甲基化介导的SOC2降解，从而增强SOC2的表达，从而抑制肝癌的进展[11]。相反的，在乳腺癌中METTL3通过M6A修饰增强HBXIP的表达，从而进一步促进乳腺癌的进展[13]。然后METTL3在结直肠癌中的作用机制仍不明显，需要进一步探索。

本研究着眼于METTL3 mRNA在结直肠癌中的差异表达出发，探索其在结直肠癌中作为癌基因的作用，以及其与结直肠癌临床病理之间的关系。本研究不仅证实了METTL3 mRNA及蛋白在结直肠癌标本中高表达，高表达的患者生存时间较低表达患者短，同时本研究探索出METTL3 mRNA在Cut-off值，为后续的临床研究提供方向。本研究的局限是结果建立在67例样本之上，需要更大的样本量来支撑。非常有趣的是，METTL3 mRNA和蛋白的表达在本研究中与淋巴结转移存在显著性关系，然而与远处转移未存在明显关系，这可能提示METTL3的作用地位集中在疾病进展期间。这也需要大量的后续研究来证实。

综上所述，METTL3 mRNA和蛋白在结直肠癌中高表达，与结直肠癌的淋巴结转移存在密切关系。故而，METTL3可作为预测结肠癌分化水平和转移的重要指标，为以后治疗及药物研发提供了重要依据。关于METTL3在结直肠癌的发生与发展中的调控作用及其分子机制有待进一步研究。