离子液体超声辅助提取黑豆皮花青素及其抗氧化活性研究

2019-07-09赵东江柴宝丽迟彩霞

中国酿造 2019年6期

苏适，赵东江，柴宝丽，迟彩霞

（绥化学院食品与制药工程学院，黑龙江绥化 152061）

黑豆为豆科植物大豆的干燥种子，味甘性平，含有不饱和脂肪酸、蛋白质、碳水化合物、纤维素、花青素、硒、磷、铁多种微量元素和营养成分[1]。此外，黑豆还含有多种具有生理功效的物质，如黑豆红色素、多糖和皂苷等。其中花青素是黑豆色素的重要成分，具有较强的抗氧化能力，对机体代谢过程中产生多余的自由基，并且对增加血管弹性、延缓机体衰老等都有一定的作用[2-3]。黑豆比黄豆有更高的医药价值和开发前景，花青素属于类黄酮类的化合物，黑豆皮色素含量高，是一种天然、安全、健康的食用色素。

目前，采用浸提法提取花青素的应用较多，但此法溶剂用量大，耗时长，且花青素得率较低[4]。超声提取法在中草药提取中应用较多，利用超声波的空化效应和机械效应，破坏植物组织细胞[5-7]，加强成分的溶出和扩散，将植物中的化学成分快速提取，提高产物的得率，具有操作简单方便，耗时短，不破坏有效成分、提取液杂质少等特点。离子液体（ionic liquid）是在室温条件下完全由离子组成的液体物质[8-12]。离子液体能够吸收超声波，可用于超声辅助提取的天然产物的溶剂，具有理化性质稳定、不易燃烧、提取过程萃取能力好、可重复利用，在黏度、极性、密度、蒸气压等方面具有和传统溶剂不同的特殊性质[13-16]，同时可以通过超声或升高温度等方法提高有效成分的得率，保持其高溶解性和萃取能力[17-18]。本文以黑豆皮为原材料提取花青素，通过响应面法得出最佳的提取工艺，同时研究花青素的抗氧化活性，为深入研究其应用价值提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青仁黑豆：黑龙江省市售。

原花青素标准品：中国药品生物制品检定所；1-己基-3-甲基咪唑溴盐（纯度99%）：阿尔法试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

VGT-2013QT超声波清洗器：广州固特超声仪器有限公司；XV-9200紫外分光光度计：北京市精密仪器厂；DFYX500高速万能粉碎机：北京科伟永兴仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 黑豆皮花青素的提取

黑豆轻微粉碎→人工剥离豆皮→豆皮粉碎→60℃烘干至质量恒定→过60目筛→称质量→超声波提取→提取液离心（离心30 min，转速3 500 r/min）→花青素

提取剂为体积分数70%乙醇稀释的1-己基-3-甲基咪唑溴盐，超声功率300 W，温度40℃，提取时间40 min，料液比1∶35（g∶mL）。

1.3.2 花青素得率计算

移取1.0 mL提取液，置于25 mL容量瓶中，定容，在波长530 nm处测定吸光度值，采用香草醛-盐酸法测定黑豆皮花青素的质量浓度，计算花青素得率，其计算公式如下：

式中：Y为花青素得率，mg/g；C为花青素质量浓度，mg/mL；V为定容体积，mL；n为稀释倍数；M为黑豆皮质量，g。

1.3.3 黑豆皮花青素提取工艺优化单因素试验

准确称取黑豆皮1.0 g，采用离子液体-超声辅助法提取黑豆花青素，考察离子液体1-己基-3-甲基咪唑溴盐浓度（0.4 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L、1.0 mol/L、1.2 mol/L、1.4 mol/L）、提取时间（15 min、25 min、35 min、45 min、55 min、65 min）、料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70）、提取温度（20 ℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）对黑豆皮花青素得率的影响，以黑豆皮花青素得率为指标，以确定响应面设计的水平。

1.3.4 黑豆皮花青素提取工艺优化响应面试验设计

根据单因素试验，选取离子液体浓度（A）、提取时间（B）、液料比（C）、提取温度（D）为考察因素，黑豆皮花青素得率（Y）为响应值，根据Box-Behnken Design中心组合设计原理，优化黑豆皮花青素提取工艺，因素与水平见表1。

表1 黑豆皮花青素提取条件优化响应面试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for extraction conditions optimization of anthocyanin from black soybean peel

1.3.5 黑豆皮花青素抗氧化能力的测定

采用水杨酸法测定黑豆皮花青素对羟自由基清除能力，在比色管中依次先加入9 mmol/L FeSO4、9 mmol/L乙醇-水杨酸以及适量去离子水，最后加入8.8 mmol/L H2O2后摇匀，37℃水浴加热15 min后取出，测其吸光度值A0。测定时，参比溶液为不加双氧水的体系。按照式（1）计算OH·的清除率。以维生素C（vitamin C，VC）为阳性对照。

式中：A0为空白对照的吸光度值；Aa为分别加入花青素、VC的吸光度值；Ab为不加H2O2的吸光度值。

分别量取0.05mg/mL、0.10 mg/mL、0.15mg/mL、0.20mg/mL、0.25 mg/mL、0.30 mg/mL的黑豆皮花青素提取液和0.1 mol/mL DPPH·溶液各2 mL，置于10 mL比色管中混合，加入体积分数60%乙醇定容，避光室温条件放置30 min，波长517 nm处测其吸光度值。以无水乙醇溶液代替样品溶液作对照，按照式（2）计算DPPH·清除率。VC对DPPH·清除率的测定同上述操作。

式中：A m为对照品的吸光度值；A n为样品的吸光度值。

2 结果与分析

2.1 黑豆皮花青素提取工艺优化单因素试验结果分析

2.1.1 离子液体浓度对花青素得率的影响

由图1可知，随离子液体1-己基-3-甲基咪唑溴盐浓度的增加，花青素的得率逐渐变大，当1-己基-3-甲基咪唑溴盐浓度为0.8 mol/L时，花青素得率达到最大值，但随着离子液体浓度继续增大，得率逐渐下降。原因可能是与提取溶剂的黏度相关，离子液体的浓度过高，提取液黏度也会增大，提取剂的扩散能力变差，难以渗到黑豆细胞的内部，使得离子液体对黑豆花青素的溶出能力降低。因此，最佳离子液体浓度为0.8 mol/L。

图1 离子液体浓度对花青素得率的影响Fig.1 Effect of ionic liquids concentration on anthocyanin yield

2.1.2 提取时间对花青素得率的影响

由图2可知，随提取时间的不断延长，花青素得率呈现增长趋势，提取时间为45 min时，得率达到最大值，但时间＞45 min之后，得率开始降低。随着超声时间继续延长，通过超声波空化作用和机械震动的持续作用，黑豆皮花青素向溶剂中逐渐溶出，得率逐渐升高；但是提取时间过长导致细胞组织中大量细胞破裂，增加了其他杂质的溶出；同时，提取时间过长会破坏花青素的结构，从而使得率下降。因此，最佳提取时间选择45 min。

图2 提取时间对花青素得率的影响Fig.2 Effect of extraction time on anthocyanin yield

2.1.3 料液比对花青素得率的影响

由图3可知，随着料液比的减小，花青素得率逐渐增大，料液比为1∶50（g∶mL）时，花青素得率达到最大值，但料液比＜1∶50（g∶mL）之前，花青素的得率开始下降。原因可能是黑豆皮的质量一定，提取剂的料液比过大，离子液体有一定的黏度，不利于花青素在溶剂中扩散；随着料液比的减小，原料在溶液中与提取液的接触面积增大，有利于花青素的溶出；但大量溶剂会吸收一定的超声波，降低了超声波对细胞的破碎能力，导致细胞内花青素溶出减少；还可能是1-己基-3-甲基咪唑溴盐与花青素分子上的羟基之间存在氢键作用，随着料液比的不断减小，氢键作用逐渐增强，导致花青素的得率降低。因此，最佳料液比选择1∶50（g∶mL）。

图3 料液比对花青素得率的影响Fig.3 Effect of material-liquid ratio on anthocyanin yield

2.1.4 提取温度对花青素得率的影响

由图4可知，随着提取温度的升高，花青素得率逐渐增大，当提取温度为50℃时，得率最大，但温度继续升高，花青素得率出现不断降低的趋势。原因可能是随着体系的温度升高，离子液体的运动速率和频率也不断变大，使其更容易渗透到黑豆皮组织细胞中，加速花青素的溶出，从而增加花青素的得率。但继续升高体系的温度，过高的温度会使花青素结构上的酚羟基发生氧化，导致其结构被破坏；也可能因为随着温度升高，细胞中其他内容物溶出增多，导致溶液黏度增大，影响花青素向外溶出，从而使得率下降。所以，最佳提取温度为50℃。

图4 提取温度对花青素得率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on anthocyanin yield

2.2 黑豆皮花青素提取工艺优化响应面结果与分析

2.2.1 响应面试验设计及结果

表2 黑豆皮花青素提取条件优化响应面试验结果与分析Table 2 Results and analysis of response surface methodology for extraction conditions optimization of anthocyanin from black soybean peel

2.2.2 响应面试验的建立与分析

表3 响应面试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface methodology results

采用Design-Expert8.0.6软件对表2数据分析，得到二次回归拟合方程Y=4.21+0.084A+0.039B+0.080C-0.017D-0.025AB+2.750E-003AC-0.027AD-0.020BC+0.023BD-0.020CD-0.37A2-0.17B2-0.10C2-0.20D2。对回归方程进行方差分析，结果见表3。

由表3可知，P＜0.000 1，说明数据模型方程达到极显著水平；失拟值P=0.997 2＞0.05，无显著差异，说明回归方程与试验拟合良好，误差小。回归方程各项方差分析表明，回归模型一次项A、B、C对模型影响极显著（P＜0.01），二次项A2、B2、C2和D2对模型影响极显著（P＜0.01），其余各项对黑豆皮花青素得率影响均不显著（P＞0.05）。因此，可用此模型对黑豆皮花青素提取工艺进行分析及预测。

2.2.3 响应面分析

响应曲面图可以显著反映各因素之间相互作用的强弱，采用Box-Behnken软件对响应曲面图进行分析，可以得到各因素交互作用对响应值的影响，结果如图5所示。

如果响应曲面较陡峭，说明该因素对花青素得率的影响较大，响应值对于提取条件的改变就越敏感；如果响应曲面相对平缓，说明该因素的波动对响应值的影响较小。由图5可知，离子液体浓度与提取温度之间交互作用的响应曲面最陡峭，对响应值影响最显著；离子液体浓度与提取时间之间交互作用的响应曲面相对陡峭，说明对响应值影响显著程度次之；提取时间与提取温度、料液比与提取温度、提取时间与料液比、离子液体浓度与料液比的交互作用对得率的影响显著程度逐渐减小，表现为曲线较为平滑，响应值无显著性变化。可知，影响黑豆皮花青素得率的各交互作用因素顺序为AD＞AB＞BD＞CD＞BC＞AC。

图5 各因素交互作用对花青素得率影响的响应面和等高线Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factor on anthocyanin yield

2.2.4 验证试验

结合单因素试验，分析回归模型，经过验证，最终得出黑豆皮花青素的最佳提取条件：离子液体浓度0.93 mol/L，提取时间45.39 min，料液比1∶53.97，提取温度43.96 ℃，花青素得率的理论预计值为4.13 mg/g。结合试验实际情况，最终选择离子液体浓度0.9 mol/L，提取时间45 min，料液比1∶53（g∶mL），提取温度43℃，进行5次平行试验，得到花青素得率平均值为4.12 mg/g，与预测值接近，验证了此模型的有效性，说明预测模型与实际情况拟合较好。