基于主成分分析与聚类分析综合评价不同菌种发酵刺梨果渣的香气品质

陈思奇，孟 满，杜勃峰，肖仕芸，丁筑红*

（贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025）

刺梨（Rosa roxburghii Tratt）为蔷薇科多年生落叶灌木缫丝花的果实，刺梨富含维生素C、黄酮、多糖、多种人体必需氨基酸和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等多种营养物质[1]。目前刺梨资源开发中占鲜果40%～50%的果渣综合利用率低，浪费严重[2]。果渣资源化利用的生物发酵技术已有研究报道，主要集中在提高与改善膳食纤维[3-4]，合成营养素[5-6]，生产饲料等方面[7-8]。前期研究发现，嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）GIM.1.208、戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）CICC.22210、生香酵母（aroma-producing yeast）和醋酸杆菌（Acetobacter pasteurianus AS1.41）GIM.1.67能够明显改善发酵刺梨果渣膳食纤维理化特性[9]，提高其功能活性，但对其食用品质，特别是风味变化及香气特征缺乏研究。

目前挥发性物质分析鉴定和分类研究可采用感官评价、主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚类分析（cluster analysis，CA）等方法[10]，感官评价存在着极大的主观因素，采用主成分和聚类分析在挥发性成分含量与香气描述语等数据的处理中可得到较好的实验结果[10-13]。本实验在顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）联用技术检测基础上，采用SPSS软件对检出的香气成分进行主成分分析和聚类分析，构建刺梨果渣的香气品质评价模型，获得不同菌种发酵刺梨果渣风味品质的综合得分及其分布，以感官评价法验证，旨在找到一种更加客观的综合评价方法，为刺梨果渣产品开发加工和提高综合利用度提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料和菌株

刺梨：品种为贵农5号，采摘于贵州龙里县，充分成熟，挑选新鲜无霉烂变质，冷冻保藏（-10℃），将刺梨榨汁后取果渣（出汁率50%）备用。

菌种：嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）GIM.1.208、戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）CICC.22210：购于贵州轻化工中心；醋酸杆菌（Acetobacter pasteurianus AS1.41）GIM.1.67：广东省微生物菌种保藏中心；生香活性干酵母：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 化学试剂

葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸钠、吐温-80、碳酸钙、磷酸氢二钾、硫酸镁（七水）、硫酸锰（七水）均为国产分析纯。

1.1.3 培养基

MRS培养基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，乙酸钠5.0 g，柠檬酸钠0.05 g，吐温-80 1.0 mL，K2HPO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·7H2O 0.05 g，碳酸钙20.0 g，琼脂（1.5 g/100 mL），蒸馏水1000 mL，自然pH，121℃，0.1 MPa灭菌30 min，37℃静置培养24～48 h，用于乳酸菌扩大及斜面菌种培养。

1.2 仪器与设备

HP6890/5975C GC/MS联用仪：美国安捷伦公司；SPX-150BⅢ型电热恒温培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；LS-50HG立式压力蒸汽灭菌锅：江阴滨江医疗设备有限公司；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司；JYZ-E6T型九阳榨汁机：九阳股份有限公司；XMTD-204数显恒温水浴锅：上海梅香仪器有限公司；57304-手动固相微萃取装置：美国Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵菌种的培养

醋酸杆菌活化：葡萄糖10.0 g，酵母膏10.0 g，碳酸钙15.0 g，无水酒精20.0 mL，琼脂20.0g，蒸馏水1 000 mL，不调pH，无水酒精在培养基灭菌后冷却至50～60℃加入，冷却至室温接种醋酸杆菌，置于30℃静置培养24～48 h备用。

酵母菌活化参照文献[14]进行改进如下：在酵母菌粉中按质量比1∶20加入35～40℃的温水，使其均匀分散，加入5%的蔗糖，活化20～30 min。待菌液降至室温接种酵母菌。

乳酸菌活化[9]：MRS活化培养液121 ℃、0.1 MPa灭菌30 min，冷却至室温分别接种嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）GIM.1.208、戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）CICC.22210的保藏培养物，37℃静置培养24～48 h备用。

1.3.2 不同菌种发酵刺梨果渣

500 mL三角瓶中添加50 g刺梨果渣，按料液比1∶5（g∶mL）加入蒸馏水，用棉塞塞紧瓶口，煮沸灭菌10 min，待其冷却后于无菌操作台分别以接种量10%接入上述活化醋酸菌、酵母菌、乳酸菌扩大培养的种子液（106～107CFU/mL），在自然pH条件下，将发酵液分别以发酵温度28℃、30℃、37℃条件下发酵48 h后进行GC-MS检测。

1.3.3 刺梨果渣香气SPME-GC-MS检测

固相微萃取条件：取15 g发酵果渣，置于25 mL固相微萃取仪采样瓶中，插入装有2 cm-50/30μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纤维头的手动进样器，在85℃左右顶空萃取30 min取出，快速移出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口（温度250℃）中，热解吸3 min进样。

GC条件：色谱柱为ZB-5MSI弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），柱温42℃（保留2 min），以4℃/min升温至280℃，保持2 min；汽化室温度250℃；载气为高纯氦气（He）（纯度99.999%）；柱前压7.62 psi，载气流量1.0 mL/min；不分流进样；溶剂延迟时间：1.5 min。

MS条件：离子源为电子电离（electronic ionization，EI）源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70 eV；发射电流34.6μA；倍增器电压1 425 V；接口温度280℃；质量范围20～450 amu。

定性定量分析：对总离子流图中各峰经质谱计算机数据系统检索、人工解析图谱及与美国国家标准技术研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）2008和Wiley275质谱库匹配，确认香气成分的各化学组成，只有当正反匹配度均＞800（最大值1 000）的鉴定结果才予以确认，用峰面积归一化法确定各化学成分的相对含量。

1.3.4 刺梨果渣香气感官评定

感官评分采用9点标度法[15]。由10位经过一定训练的评价人员（相关专业的老师和学生共10名）组成的评分小组按感官评分标准对不同菌种发酵刺梨果渣香气进行加权评分，将其平均分作为最终得分，权重及感官评分标准见表1。

表1 发酵刺梨果渣感官评定标准Table 1 Sensory evaluation standards of fermented Rosa roxburghii pomace

1.3.5 数据处理

采用IBM SPSS Statistics 23.0对刺梨果渣挥发性物质进行PCA和CA分析，Excel2016制作模型得分图。

2 结果与分析

2.1 不同菌种发酵的刺梨果渣香气成分种类及相对含量

采用HS-SPME-GC-MS技术对刺梨果渣的香气成分进行检测，得到不同菌种发酵的刺梨果渣香气成分种类以及相对含量，结果分别见表2、表3。

表2 不同菌种发酵刺梨果渣的GC-MS分析结果Table 2 Analysis results of Rosa roxburghii pomace fermented by different strains by GC-MS

续表

续表

表3 不同菌种发酵刺梨果渣香气成分种类及相对含量Table 3 Species and relative contents of aroma components of Rosa roxb urghii pomace fermented by different strains

由表2和表3可知，刺梨原果渣与不同菌种发酵的果渣共检测鉴别出110种香气成分，其中对照组原果渣检出79种，GIM.1.67、酵母菌、CICC.22210、GIM.1.208组分别检出56种、62种、55种、65种。共同检出的风味物质为烃类、醇类、酯类、酸类、醛类、酮类和其他等7类化合物。其中5种果渣中烃类物质数量及含量明显高于其他种类物质，相对含量为49.184%～58.036%。烃类一般香气阈值较高，除了可延长发酵果渣香气留香时间外，香气直接贡献不大[16-18]。醇类物质是微生物通过氨基酸代谢产生[19]，主要呈现清香和青鲜香气[20]，是刺梨果渣香气成分的重要组成部分，相对含量为3.494%～12.598%。GIM.1.67与CICC.22210发酵果渣后都产生了新成分橙花醇，呈玫瑰花香；异戊醇是酵母发酵的产物，赋予果渣愉快的果香和花香[21]；苯乙醇也为酵母发酵的特有产物[22]，其本身具有花香、甜、清香和玫瑰香气，除本身愉快的风味外，还可作为其他易挥发风味物质的溶剂[23]，对发酵果渣的风味具有双重影响功能。酯类物质相对含量为0.226%～11.285%，酵母菌组酯类物质的种类与含量相对更加丰富，可能因为该生香酵母菌发酵具有很强的产香能力，尤以产酯香为主的香味物质最多[24]。酯类物质大多具有不同水果香气[25-27]，阈值一般较低，是刺梨果渣整体香气形成的重要组成部分。酸类物质的相对含量为2.511%～22.152%，对照组及处理组发酵后均检出辛酸，可以作为酯类物质的前体物质[23]，对果渣风味起到间接作用。GIM.1.208和CICC.22210组酸类相对含量较高，酸涩气味强烈，可能与其较高含量的挥发性脂肪酸类物质辛酸有关[28]。醛酮类物质也是刺梨及发酵产物特征香气的重要挥发性成分[29]，高浓度的醛类物质会带来异味[30]，且醛类物质不稳定，在微生物作用下被还原为醇或被氧化为酸[31]，可能是发酵后的刺梨果渣较原果渣相比，醛类相对含量减少，醇类、酸类相对含量增多的原因之一。

从整体上看，不同样品的香气成分构成及含量差异较大，表明不同处理组之间风味特征及风味品质具有差异性，进而采用PCA和CA的方法对刺梨果渣进行综合评价与品质区分，便于对后期菌种的筛选与相关果渣产品的加工生产的指导。

2.2 不同菌种发酵刺梨果渣香气成分主成分分析

2.2.1 主成分分析结果

将表3数据标准化，以各样品组检测出的香气成分种类的相对含量矩阵为指标，用SPSS进行主成分分析，得到主成分特征根及特征向量，以风味物质贡献率97%以上为标准，确定主成分个数及每个主成分所反映的因子，结果见表4和表5。

表4 提取3个主成分的特征值以及方差贡献率Table 4 Eigenvalues and variance contribution rates of extracted three principal components

由表4可知，取特征值＞1的成分为主成分，得到3个主成分，且这3个主成分的方差累计贡献率达到97.367%，表示能够解释刺梨果渣香气大部分的成分信息，因此，选择这3个主成分进行风味品质分析。

表5 主成分的特征向量与载荷矩阵Table 5 Eigenvector and loading matrix of principal components

图1 不同菌种发酵刺梨果渣香气成分主成分分析载荷图Fig.1 Principal component analysis load diagram of aroma components of Rosa roxburghii pomace fermented by different strains

由表4、表5结合图1可以看出，第1主成分的方差贡献率为44.073%，主要反映醇类、酯类这2种香气成分的变异信息，且第1主成分与两者呈正相关；第2主成分的方差贡献率为33.679%，主要反映酸类、醛类这2种香气成分的变异信息，与酸类呈负相关，与醛类呈正相关；第3主成分的方差贡献率为17.615%，主要反映烃类、酮类的变异信息，与烃类呈负相关，与酮类呈正相关。由于PC1能够概括大部分香气成分信息，影响其化合物可作为主要风味化合物。因此，醇类和酯类是不同菌种发酵刺梨果渣的香气差异化的的主要影响因素。

2.2.2 基于主成分分析建立香气品质评价模型

根据表4和表5，以3个主成分代表原来7种风味成分所表达的信息，建立不同样品风味品质的评价模型，得出以下刺梨果渣风味成分的线性关系式，式中X1～X7为不同物质种类相对含量标准化后的值，Y1、Y2和Y3表示3个主成分的得分分值，分值越大，表示果渣风味品质越好。

将表5的特征向量进行标准化处理，与所对应的3个主成分旋转之前的方差贡献率做内积，得到综合风味品质的评价函数Y的表达式为Y=0.440 73Y1+0.336 79Y2+0.176 15Y3，得到的风味评价综合得分值及排序见表6。

表6 标准化后主成分综合得分Table 6 Comprehensive score of principal components after standardization

由表6可知，第1主成分得分最高的为酵母菌组，其次为GIM.1.67组，第2主成分得分最高的为GIM.1.67组，第3主成分得分最高的为对照原果渣组。综合评价，菌株GIM.1.67发酵的刺梨果渣得分最高，为0.933分，其次为酵母菌组、原果渣组、CICC.22210组、GIM.1.208组。

2.3 不同菌种发酵刺梨果渣香气成分聚类分析

采用聚类分析以评估各样品香气成分的变化，具有最大相似度的样品被优先聚类，通过SPSS23.0软件，以类间平均距离法为测量方法，以Euclidean距离作为度量标准，将5种刺梨果渣样品的香气成分聚类成树状图见图2。

图2 聚类分析树状图Fig.2 Dendrogram for cluster analysis

由图2可知，当Euclidean距离等于5时，CICC.22210组与GIM.1208组被聚为一类，说明这2种菌种发酵刺梨果渣后整体风味轮廓相似。当Euclidean距离增加到25时，GIM.1.67组才与其他组样品聚为一类，说明GIM.1.67组与其他样品之间相似度较低，整体风味轮廓不同。刺梨原果渣与发酵之后的果渣风味轮廓具有差异性，表明了经过不同菌种发酵后，刺梨果渣风味改变显著，CA结果与PCA结果相一致。

2.4 不同菌种发酵刺梨果渣感官评价分析

通过感官评价可以进一步验证与所建立的香气模型是否具有一致性[32]。本实验按感官评分标准（见表1）对不同菌种发酵刺梨果渣香气进行加权评分，将其平均分作为最终得分，与模型评价结果进行验证，感官评价结果见表7。

表7 不同菌种发酵刺梨果渣香气感官评价结果Table 7 Sensory evaluation results of aroma in Rosa roxburghii pomace fermented by different strains

由表7可知，感官评分由大到小依次为GIM.1.67组、酵母菌组、原果渣组、CICC.22210组、GIM.1.208组，通过GIM.1.67发酵后刺梨果渣被赋予了浓厚的发酵香气，且刺梨香浓郁，获得了比原果渣更加协调的香气。通过对比所建立的香气品质评价模型得分，两者具有较好的一致性。由此可见，基于主成分分析法初步构建的香气品质综合评价模型具有可靠性及适用性。

3 结论

采用HS-SPME-GC-MS鉴别不同菌种发酵刺梨果渣的香气成分。刺梨原果渣与4种不同菌种发酵的果渣总共检测鉴别出110种香气成分，包括烃类、醇类、酯类、酸类、醛类、酮类和其他类化合物。其中刺梨原果渣检出79种，GIM.1.67、酵母菌、CICC.22210、GIM.1.208发酵后分别检出56种、62种、55种、65种。通过主成分分析，醇类和酯类是影响不同菌种发酵刺梨果渣的香气的主要因素。利用主成分分析建立风味品质综合评价模型，可以计算出GIM.1.67发酵的刺梨果渣得分最高，为0.933分，其次为酵母菌发酵、原果渣、CICC.22210发酵、GIM.1.208发酵。通过感官法评价验证，对比所建立的香气品质评价模型得分，两者具有较好的一致性。通过聚类分析，当Euclidean距离等于5时，CICC.22210发酵与GIM.1208发酵被聚为一类，说明2种菌种发酵刺梨果渣后整体风味轮廓相似。刺梨原果渣与发酵之后的果渣风味轮廓具有一定差异性，表明了经过不同菌种发酵后，刺梨果渣风味改变显著。由此可见主成分分析法与聚类分析法能较好地反映刺梨果渣样品的差异性。