黄芪甲苷抑制IKK/NF-κB炎症通路减轻高糖诱导的H9c2心肌细胞损伤*

张书春 ，代紫阳 ，王 亚 ，夏 娟 ，杜梦凡 ，姚 纹

（1.唐山南湖医院，唐山 063000；2.华北理工大学中医学院，唐山 063210）

糖尿病是一种多病因引起的以高血糖为特征的内分泌代谢性疾病。高血糖还可通过诱导、加重炎症反应、氧化应激等机制在糖尿病诸多并发症的发生、发展过程中占重要地位。糖尿病性心肌病是一种常见的糖尿病心血管并发症，是独立于高血压性心脏病、冠状动脉粥样硬化性心脏病的心肌损害性疾病。研究显示炎症反应在糖尿病心肌损害的发生、发展过程中起重要的作用[1]。其中，在糖尿病心肌损伤相关动物、细胞模型中存在大量炎症细胞因子如白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的分泌及炎症相关信号分子如核转录因子-κB（NF-κB）等的过度激活，持续存在的炎症反应最终导致心肌损害的发生[2-4]。黄芪甲苷是中药黄芪所含有的重要有效化学成分之一，具有明确的降糖、调脂作用[5]，且通过抗氧化应激、抗炎、抗细胞凋亡等机制对心血管系统具有广泛的保护作用[6]。本研究旨在观察黄芪甲苷对高糖诱导H9c2心肌细胞损伤的保护作用，并从 IκB 激酶（IKK）/NF-κB 炎症相关通路探讨其作用机制。

1 材料与仪器

1.1 细胞株 大鼠胚胎心脏组织来源的H9c2细胞株，购自中科院上海细胞库。

1.2 实验用药 黄芪甲苷购自辽宁生物医药科技有限公司。

1.3 试剂 DMEM高糖、低糖培养基（GIBCO公司），胰蛋白酶（SIGMA公司），胎牛血清（GIBCO公司），噻唑蓝（MTT）细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（碧云天生物技术研究所），TNF-α、IL-6（南京建成生物工程研究所），兔抗大鼠IKK-β、NF-κB、p-NF-κB（Ser536）、TNF-α（Cell Signaling 公司），辣根过氧化物酶标记山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所）。

1.4 仪器 37℃二氧化碳孵箱，上海易亮医疗器械有限公司；超净工作台，江苏苏州净化设备公司；冷冻离心机，德国SIGMR Laborzentrifugen；酶标仪，奥地利TECAN公司；JY200C电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司；半干转运系统，BIO-RAD公司。

2 方法

2.1 细胞培养 37℃、5%CO2条件下孵育H9c2细胞，给予 10%FBSDMEM（低糖，5.5 mmol/L）培养基培养，待细胞生长融合约覆盖皿底面积80%时进行传代。无血清低糖DMEM培养基培养细胞24 h，使各组细胞生长同步化后再进行下一步实验。

2.2 MTT法检测细胞活性 细胞贴壁生长48 h，吸弃每孔原培养基，加入新培养基100μL，再加入MTT溶液10μL，置细胞于培养箱内继续孵育4 h。每孔加入DMSO 150μL，于细胞培养箱继续孵育细胞15 min，使用酶标仪测定吸光度OD值（波长570 nm）。

2.3 高糖诱导心肌细胞损伤模型的建立 根据文献研究[7]及预实验的实验结果，以高糖（33.3 mmol/L）培养基处理H9c2心肌细胞24 h建立心肌细胞损伤模型。

2.4 黄芪甲苷对细胞活力的影响 选择对数生长期H9c2心肌细胞，胰酶消化后重悬细胞，进行细胞计数，以2 000个细胞/孔的密度接种于96孔细胞培养板。黄芪甲苷（20、40、80μmol/L）预处理 6 h，再加入高糖培养基24 h，MTT法检测细胞活性。

2.5 分组及处理 正常对照组：给予10%FBS低糖DMEM培养基培养；高糖对照组：给予10%FBS高糖DMEM培养基培养；高糖+黄芪甲苷低剂量组：黄芪甲苷（20μmol/L）预处理6 h，再给予10%FBS高糖DMEM培养基培养；高糖+黄芪甲苷中剂量组：黄芪甲苷（40μmol/L）预处理6 h，再给予10%FBS高糖DMEM培养基培养；高糖+黄芪甲苷高剂量组：黄芪甲苷（80μmol/L）预处理6 h，再给予10%FBS高糖DMEM培养基培养。

2.6 酶联免疫吸附（ELISA）法检测 TNF-α和IL-6的含量待细胞生长融合约覆盖皿底面积80%时，按照分组给予不同处理后，收集培养基作待测标本，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，测定出细胞培养液中TNF-α和IL-6的含量水平。实验重复5次。

2.7 Western Blot检测 IKK、NF-κB、p-NF-κB（Ser536）、TNF-α水平吸弃各组细胞培养液上清，加入IP细胞裂解液冰上裂解30 min，刮取细胞，离心 15 min（4℃，12 000 r/min）。BCA 法测定细胞蛋白浓度。制备分离胶（10%）和浓缩胶（5%）。上样总蛋白100μg，加入电泳缓冲液，设定电泳电压及时间（浓缩胶∶80 V，40 min；分离胶∶150 V，1 h）。再将蛋白转移至PVDF膜上（52 mA，2 h）。5%脱脂奶粉封闭1 h， 加 入 相 应 一 抗 （IKK、NF-κB、p-NF-κB（Ser536）、TNF-α、GAPDH），4℃过夜。洗膜后孵育HRP标记的山羊抗兔或山羊抗小鼠第二抗体，室温2 h。再次洗膜后，ECL显色，暗室内曝光。结果用Image J软件分析，计算蛋白条带灰度值，目的蛋白表达水平用目的蛋白与内参蛋白的灰度比值来表示。

2.8 数据处理 应用SPSS 23.0统计软件对数据进行分析，实验所得数据采用均数±标准差（x±s）表示，各组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐者选用LSD法，方差不齐者选用Dunnett’s T3法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 不同浓度黄芪甲苷对各组细胞存活率的影响 与正常对照组相比，高糖对照组的细胞存活率明显下降（P＜0.05）；与高糖对照组相比，高糖+黄芪甲苷（20、40、80μmol/L）各组的细胞存活率有所提高，且黄芪甲苷对细胞存活率的提高效果呈剂量依赖性。在黄芪甲苷药物治疗组中，高糖+黄芪甲苷高剂量组（80μmol/L）组的细胞存活率最高（P＜0.05）。见表1。

表1 不同处理因素对高糖诱导的心肌细胞存活率的影响（x±s）Tab.1 Effects of different treatment factors on the survival rate of myocardial cells induced by high glucose（x±s）

3.2 各组细胞培养液上清TNF-α和IL-6的含量 与正常对照组相比，高糖对照组细胞培养液上清中TNF-α和IL-6的含量均明显增加（P＜0.05）；与高糖对照组相比，高糖+黄芪甲苷（20、40、80 μmol/L）各组的TNF-α和IL-6在细胞培养液上清中的含量均有所降低（P＜0.05），且降低效果呈黄芪甲苷剂量依赖性，以高糖+黄芪甲苷高剂量组（80μmol/L）下降最为显著（P＜0.05）。见表 2。

表2 各组心肌细胞培养液上清TNF-α和IL-6的含量（x±s）Tab.2 Supernatant contents of TNF-αand IL-6 in each group（x±s）ng/L

3.3 黄芪甲苷对H9c2细胞IKK-β，NF-κB，p-NF-κB，TNF-α蛋白表达的影响 与正常对照组比较，高糖对照组H9c2细胞IKK-β蛋白表达增加显著（P＜0.05），NF-κB 蛋白表达无明显变化（P＞0.05），但NF-κB 磷酸化水平显著增加（P＜0.05），TNF-α 蛋白表达明显升高（P＜0.05）。黄芪甲苷各处理组H9c2细胞 IKK-β 蛋白表达下降（P＜0.05），NF-κB 磷酸化水平减弱（P＜0.05），TNF-α蛋白表达明显降低（P＜0.05），且各指标变化呈现黄芪甲苷剂量依赖性，以黄芪甲苷高剂量组改变最为明显（P＜0.05）。见表 3、图 1。

表3 黄芪甲苷对H9c2细胞IKK-β，NF-κB，p-NF-κB，TNF-α 蛋白表达的影响（x±s）Tab.3 Effect of astragaloside IV on protein expressions of IKK-β，NF-κB，p-NF-κB and TNF-α in H9c2 cells（x±s）%

图1 黄芪甲苷对H9c2细胞IKK-β，NF-κB，p-NF-κB，TNF-α蛋白表达的影响Fig.1 Effect of astragaloside IV on protein expressions of IKK-β，NF-κB，p-NF-κB and TNF-α in H9c2 cells

4 讨论

糖尿病性心肌病是一种发生于糖尿病患者的特异性心肌病变，可造成糖尿病患者心力衰竭，具有较高的死亡率。糖尿病以慢性高血糖为特征，高糖刺激与炎症状态密切相关[8]，而炎症是糖尿病心肌损害的发生机制之一，亦有诸多研究表明抗炎可以有效减轻糖尿病心肌损害[9-10]。其中，TNF-α可引发炎症和细胞损伤，最终导致心肌纤维化[11]。在糖尿病心肌病大鼠模型中，抑制TNF-α可以减少心肌纤维化，改善心脏功能[12]。本实验高糖孵育H9c2心肌细胞24 h建立细胞损伤模型，细胞活力明显下降，细胞培养液上清中的炎症因子如TNF-α、IL-6水平明显升高，细胞内TNF-α的蛋白表达亦增高，提示高糖诱导的心肌细胞损伤与炎症反应密切相关。

NF-κB是广泛存在于机体内的核转录因子，是介导炎症因子释放的关键性转录因子[13]。当细胞处于静息状态时，NF-κB与抑制性蛋白IκB以复合体的形式存在，处于未激活、无活性状态；当细胞受到多种因素刺激后，IκB激酶复合体（IKK）中的催化亚基IKK-β将IκB磷酸化并使之降解，从而NF-κB被磷酸化激活。磷酸活化的NF-κB转移至细胞核内，与特定靶基因结合并调控靶基因转录，释放IL-6、TNF-α等相关炎症因子[14]。而TNF-α、IL-6等炎症因子的释放可反馈性作用于NF-κB，使之处于持续激活状态，进而持续的炎症状态造成心肌损伤[15]。本实验高糖诱导的心肌细胞损伤模型中IKK-β蛋白表达增加，NF-κB磷酸活化水平加强，提示IKK/NF-κB炎症相关通路过度激活。

黄芪甲苷是黄芪的主要活性成分之一，其降糖、治疗糖尿病并发症的药理作用明确[16-17]。黄芪甲苷可增强心肌收缩力，改善心肌能量代谢，抑制心室肥厚、心肌纤维化及心肌细胞凋亡，保护血管内皮细胞，降血压，对心血管系统具有广泛的保护作用[18-20]。然而糖尿病心肌损害的发病机制十分复杂[21]，黄芪甲苷究竟是通过哪些路径来保护心肌细胞避免其受高血糖损害还需进一步探索。本实验结果显示，给予H9c2心肌细胞黄芪甲苷预处理6 h可以明显增强高糖孵育条件下的心肌细胞活力，降低细胞培养液上清TNF-α、IL-6水平，减弱细胞内TNF-α的蛋白表达，并明显抑制过度激活的IKK/NF-κB炎症相关通路。

综上所述，高糖刺激诱导IKK/NF-κB炎症通路的级联反应过度激活参与糖尿病心肌损伤的发生、发展过程。黄芪甲苷呈剂量依赖性对糖尿病心肌损害具有明显的防治作用，各项异常指标的改善情况以黄芪甲苷高剂量组（80μmol/L）最为显著，其可能机制是与降低IKKβ的蛋白表达，下调NF-κB的磷酸活化水平，从而抑制了IKK/NF-κB炎症通路的过度激活，继而降低了TNF-α、IL-6相关炎症因子水平有关。