小鼠死后环状 RNA的降解规律及其用于死亡时间推断的适用性

郝尔娃，吴 岳*，杨应忠，马启宁，赵洪乾，于 聪

(1.青海大学医学院，青海 西宁 816000；2.青海省海西州公安局油沙山分局，青海 茫崖 816400)

法医病理学中死亡时间(Post Mortem Interval，PMI)的推断一直没有明确统一的计算方法，是法医尸检工作中的一大难点。

应用核酸推断死亡时间是法医学研究领域中的热点，其中环状RNA(circRNAs)作为一类新近发现的分子，在法医学中的应用还在研究阶段，尚未有太多的研究资料。本研究将使用q-PCR技术检测小鼠小脑中环状RNA相对表达含量，分析circRNA用于推测PMI的实用价值。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与试剂

仪器：ABI 7500 RT-qPCR仪(美国ABI公司)，UVP 凝胶成像系统(UVP公司)，5415D高速离心机(德国Eppendorf公司)，NanoDrop 2000c核酸分析仪(美国Thermo公司)，BIO-RAD PCR扩增仪(美国伯乐公司)，DYY-6B型稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂)，鼎池12 L双核制冷医用恒温箱(艾威雷博公司)。

试剂：天根总RNA提取试剂盒(天根生化科技公司)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa宝日医生物技术公司)，TIANGEN GeneGreen核酸染料(北京天根生化科技公司)，TIANGEN SuperReal PreMix Color(SYBR Green)SuperReal彩色荧光定量预混试剂(北京天根生化科技公司)。

1.2 实验材料

成年雄性昆明小鼠50只，SPF级，体重均为25 g左右，购于西安交通大学医学部实验动物中心[合格证号：SCXK(陕)2017-003]，在青海大学医学院适应性饲养10 d。

1.3 实验方法

1.3.1 分组与处理

50只昆明小鼠随机分为两个温度组(4℃组和20℃组)，每大组25只，用断颈法处死，置于4 ℃恒温箱和20 ℃恒温箱。每个大组的小鼠按照死亡时间分为死后0、24、48、96、168 h组，每小组5只小鼠。在相应时间解剖小鼠，取小脑组织用液氮迅速冷冻，转移至-80 ℃超低温冰箱保存。以候选的四种引物分别作为候选内参计算△CT值(△CT=CT目的基因-CT内参基因)，并计算相对表达量2-△CT，带入NormFinder程序中求各个基因的稳定性M值，M值最小的即为最适内参基因。除内参基因外的circRNA都作2-△△CT转换[△△CT=实验组(CT目的基因-CT内参基因)-对照组(CT目的基因-CT内参基因)]，转换后数值代表处理组相对于对照组表达量的倍数。

1.3.2 总RNA提取及q-PCR分析

取小脑组织500 mg，于液氮中研碎，加入1 mL裂解液RZ后做匀浆处理，按照说明书步骤提取总RNA，用40 μL RNase-Free ddH2O溶解RNA，使用NanoDrop2000c核酸分析仪检测浓度与OD值，并做核酸凝胶电泳检测总RNA的完整性。提取的RNA使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂进行反转录反应，制成20 μL cDNA(体系)。使用TIANGEN SuperReal PreMix Color(SYBR Green)SuperReal彩色荧光定量试剂进行分析。本实验中所使用的circRNAs引物均为外向型引物，由上海捷瑞公司合成，序列见表1。

表1 被检指标RNA引物序列Table1 Target circRNA primer sequences

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 内参筛选结果

circRNA缺少5′和3′末端，不易被核酸外切酶降解，因而比线状RNA性质更加稳定[1]。本实验中除circRNA指标外，另加了一项常用线性内参基因——管家基因β-actin，筛选适用于circRNA定量的内参指标。结果如表2所示，CDR1as的M值为0.417，更适合作为本实验中的内参基因。

表2 NormFinder计算候选内参稳定值(M值)结果Table2 Expression stability values(M value)of candidate reference genes with NormFinder

2.2 单因素方差分析结果

小鼠死后在不同死亡时间及温度下，小脑中目的基因相对表达量2-△△CT的结果如表3所示，折线图见图1。4 ℃组与20 ℃组的Rims2 circRNA及Dym circRNA在死后24 h内的相对表达量明显降低，24 h后呈缓慢降低趋势(P<0.05)。

表3 死后各时间组目的基因相对表达量 Table3 Relative expression levels of each target genes at different

*：与同组同一目的基因0 h组相比，P<0.05

图1 4 ℃组(左)与 20 ℃组(右)目的基因相对表达量随PMI变化趋势图Figure 1 The changes of relative expression of the target genes in the group 4 ℃(left)and the group 20 ℃(right)with PMI

2.3 线性回归分析结果

对不同温度下的两种circRNA的△Ct值与PMI进行回归分析，其中PMI作为自变量x，△Ct值作为因变量y，作线性、二次及三次曲线估计，分别得到三条线性模型，结果如表4所示。4 ℃组Rims2 circRNA的三次回归模型的决定系数r2=0.752，P<0.05，Dym circRNA的三次回归模型r2=0.834，P<0.05，说明4 ℃组的PMI对△Ct值的影响很大；20 ℃组Rims2 circRNA的二次回归模型与三次回归模型的r2值相同，r2=0.544，且P<0.05，Dym circRNA的三次回归模型r2=0.512，且P<0.05，说明4 ℃组的PMI对△Ct值的影响较大。

表4 PMI与△Ct值回归分析结果Table4 The results of PMI and △Ct value regression analysis

3 讨论

死亡时间按时间经历长短分为早期死亡时间和晚期死亡时间。早期死亡时间是指死后经历时间在24 h之内，在这段时间内最简单且基础的方法是根据温度来推断，死后10 h内，每过1 h尸温下降1 ℃，而10 h之后每小时下降0.5 ℃，在此结果上夏季相对春秋季要慢1.4倍，冬季快0.7倍。德国埃森大学Claus HenΒge教授创建了综合参数法[2]，在尸温降解曲线的基础上矫正体重参数，并结合尸僵、尸斑、胃内容物消化程度等尸体变化规律进行多参数综合推断。晚期死亡时间是指死亡发生24 h以后，这时的尸体发生了腐败等一系列变化，会使尸体发生不同程度的损毁，致使推断死亡时间的难度大大增加，常用的有尸体蝇蛆的发育规律[3]、尸体周围的植物、尸体的组织酶活性[4]及细胞核酸含量[5，6]等方法。

本实验中，circRNA在24 h内的降解幅度明显大于24 h以后，说明circRNA在24 h以内的变化较大，24 h以后放缓。回归分析可见两种circRNAs的三次回归方程的回归系数更大一些，说明其受PMI的影响较大。

近年来运用DNA和RNA的降解规律来推测死亡时间成为法医工作者的一大研究热点[7]。目前对DNA的检测方法主要有流式细胞仪检测法(FCM)[8]，用其检测DNA降解率(明确与PMI的相关性)；单细胞凝胶电泳技术法(SCGE)，用其检测细胞DNA损伤(明确与PMI的关系)；计算机图像分析技术法(LAT)，用其检测细胞DNA含量[5]；显微拉曼光谱分析法，用其检测死亡后的组织细胞DNA含量(明确与PMI的关系)[9]。DNA相对稳定，且具有较为全面和精确的检测方法，常用作推测死亡时间的可靠指标。

RNA的定量检测与PMI的相关性研究中，除了经典的tRNA，mRNA和rRNA之外，还包含其他类型的RNA，包括miRNA，lncRNA，piRNA，siRNA，tmRNA，sRNA，tiRNA，eRNA，snoRNA，snRNA和其他非编码RNA。在诸多的RNA分子家族中，有一类环状RNA在数量和类型上的发现都在不断增多，引发越来越多的关注[10]。目前已知具有环状RNA分子的结构有：具有环状基因组RNA的类病毒和丁型肝炎病毒(HDV)；内含子来源的环状RNA分子；在rRNA和tRNA形成过程中的环状中间体；一些功能性非编码的环状RNA结构；以及在真核生物pre-mRNA反向剪接生成mRNA过程中产生的中间产物circRNAs，此类环状RNA最早见报道于1979年[11]。后经大量研究发现[1，12，13，14]，真核生物中的环状RNA在哺乳动物脑中含量较为丰富且序列高度保守，并且在神经分化过程中具有特异性表达和动态表达的特性。由于特殊的闭合结构，使得环状RNA对核酸外切酶的敏感性非常低，大约比线状RNA的敏感性低十倍。这也是本实验使用环状RNA作为推断死亡时间的指标的主要原因之一。

无论是应用DNA还是RNA推断死亡时间，受环境温度、湿度，死亡原因，死前损伤情况，死者胖瘦、患病与否的影响较大[15]，并与取材部位有关，想要准确推断死亡时间需要多方法多参数联合考量，并根据不同地方的不同气候条件综合出适宜的综合参数。CircRNA在死亡时间的推断中虽不能使推断更加准确，但作为一类新的分子学指标，可以与其他指标一起综合应用。

本研究限定了小鼠死后尸体存放条件，探究恒温恒湿条件下小鼠死后小脑circRNA与死亡时间的相关性，具有一定的局限性。此外，小鼠与人体存在明显的差异，同样的推断死亡的方法是否适用于人体尚需明确。