桦褐孔菌多糖的提取工艺优化及对人肝癌细胞HepG2脂肪堆积的影响

张蕾 郝婧玮 宛春雷 柴军红 赵玥 王鑫 王雪

摘要：通过L9（34）正交试验，通过MTT法选取桦褐孔菌多糖对HepG2细胞的安全浓度，检测不同浓度的桦褐孔菌多糖对胞内TG蛋白的影响，及桦褐孔菌多糖减轻细胞内脂质堆积的作用。结果表明，桦褐孔菌多糖最佳条件为 1 g ∶ 15 mL 的料液比，在温度30 ℃下提取30 min，超声功率为480 W。桦褐孔菌多糖可明显减轻HepG2细胞内脂质堆积，显著降低细胞中TG的含量，其中600 mg/L桦褐孔菌多糖对TG的清除率达24.57%，脂滴数量明显减少。说明桦褐孔菌多糖具有良好的体外降脂活性，对脂肪肝有较好的预防效果。

关键词：桦褐孔菌;多糖;HepG2细胞;甘油三酯;脂肪堆积;清除率;脂滴数量

中图分类号： R284  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）10-0201-04

非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的主要特征是肝细胞内脂肪的变性以及脂质的贮积，但同时无过量饮酒史的临床病理综合征[1]。经常伴有中心性的肥胖、高血脂症，对胰岛素的抵抗能以力及对糖的耐量异常等方面代谢综合征，严重危害人类的健康[2-4]。近年来，对NAFLD的研究很多，但对其发病机制的研究尚不清楚。因此，寻找到有效治疗NAFLD的药物非常重要。

桦褐孔菌（Phaeoporus obliquus J. Schroet），别称白桦茸，被赞誉为“西伯利亚灵芝”，为真菌门担子菌亚门层菌纲非褐菌目多孔菌科褐卧孔菌属，是一种非常珍稀而名贵的药用真菌，生长在温度相对较低的俄罗斯西伯利亚地区的原始森林中，不能人工栽培，非常稀少，颜色呈深栗色，常在树皮破损及伤节处形成肉瘤状菌核，菌块性状为近球形或不定形块状;研究发现，其化学成分包含多糖类化合物、芳香物质、多酚类化合物、三萜类化合物等物质[5-8]，具有重要的药用价值。从16世纪至今，桦褐孔菌一直被作为一种民间药物来治疗糖尿病、高血压、抗衰老等，具有显著的效果[9-10]。对于非酒精性脂肪肝病的治疗，目前还尚未见相关的研究报道。本试验通过模拟临床上NAFLD的病理特点，通过优化提取桦褐孔菌多糖提取物，将其作用于HepG2细胞，从细胞水平上来评价桦褐孔菌多糖提取物对细胞脂质堆积的影响，以及对细胞内甘油三脂含量的影响，从而揭示其在防治非酒精性脂肪肝方面的药用价值。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

桦褐孔菌购于黑龙江省绥芬河市;MTT、TG试剂盒、油酸、油红O和细胞裂解液购于上海源叶生物科技有限公司;DMEM细胞培养基、血清、胰蛋白酶等细胞试剂购于Hylone公司;乙醇、异丙醇购于北京化工厂;HepG2细胞笔者所在实验室传代保存，由哈尔滨工业大学赠送;粉碎机（戴声设备有限公司）、超声波清洗机（杭州法兰特超声波科技有限公司，总功率800 W）、电子天平（QUINTIX224-1CN Sartorius，R210）、旋转蒸发仪（瑞士BUCHI）、电子显微成像系统（CX31 Olympus）、酶标仪（Synergy HTX BioTek）、静音混合器（MT-360其林贝尔）。

1.2 桦褐孔菌多糖的提取及测定

将桦褐孔菌粉末过筛，准确称取5 g溶于醇浓度为30%的乙醇中，在一定时间、温度、料液比和超声波功率下振荡处理一定时间，用80%乙醇沉淀多糖后，4 000 r/min，离心 7 min 后取上清液，减压浓缩至浸膏后水浴至干，得粗制多糖，标准曲线法测定其含量。

1.2.1 单因素试验指标对桦褐孔菌多糖提取量的影响 设计桦褐孔菌多糖提取物单因素试验的变量条件分别为：提取温度，20、30、40、50、80 ℃;提取时间，10、20、30、40、50 min;料液比1 g ∶ 8 mL、1 g ∶ 10 mL、1 g ∶ 15 mL、1 g ∶ 20 mL、1 g ∶ 25 mL;超声功率，160、320、400、480、640 W，从而来确定正交试验中各因素的水平。

1.2.2 提取工艺正交试验优化 在单因素试验基础上，利用正交试验表L9（34）进行正交试验，各因素与水平见表1。

1.3 细胞培养及MTT法测HepG2细胞活性

复苏HepG2细胞，将实验室冻存的HepG2细胞从液氮罐中取出，迅速放于37 ℃水浴锅中融化，用PBS清洗后，1 000 r/min 离心去上清后将其放于含10% FBS的DMEM培养基中，培养条件：温度为37 ℃、体积分数为5%的CO2、饱和湿度，将培养好的HepG2细胞每隔1 d进行传代培养，并将取处于对数生长期的细胞转于10% FBS的高糖型DMEM培养基进行下一步试验。

将处于对数生长期的HepG2细胞接种于96孔细胞培养板中，并利用细胞计数板记数使每孔细胞的接种量达到104个，置于37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中孵育24 h后，设对照组和给药组（桦褐孔菌多糖提取物），给药组的终浓度分别为6、60、600、6 000、60 000 mg/L，每组设置3个平行孔，培养24 h;每孔加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，继续在37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养4 h;取出，缓慢吸去培养液，然后每孔加入100 μL的DMSO，振荡5～10 min;酶标仪 490 nm 处测吸光度。根据酶标仪的吸光度值计算细胞存活率，选择存活率达到70%以上时的桦褐孔菌多糖浓度为安全浓度。

1.4 细胞内TG

检测蛋白吸附法[11]，桦褐孔菌多糖的给药浓度分別是600、60、6 mg/L，细胞内的TG含量检测方法同陈静等对细胞内TG浓度的测量[12]。

TG清除率=（D模型-D给药）/D模型×100%。

1.5 油红O染色

油红O工作液配制：首先配制0.5%油红O储备液，将油红O粉末溶于异丙醇中，储备液用蒸馏水稀释后过滤2次，至液体澄清为止[13]。

将HepG2细胞接种于24孔板，37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中孵育24 h后取出，分为对照组、模型组、低中高浓度（600、60、6 mg/L）桦褐孔菌多糖给药组，各组所加培养基。孵育24 h后用油红O工作液染色30 min，蒸馏水吹洗2次，在倒置显微镜下观察染色效果。

1.6 统计分析

通过SPSS 13.0软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 提取时间、超声功率、提取温度、料液比分别对桦褐孔菌多糖提取率的影响

通过对比分析分别改变提取时间、超声功率、提取温度、料液比条件下桦褐孔菌多糖类物质的提取率，结果分别显示，提取时间为30 min、超声功率为320 W、提取温度为40 ℃、料液比达到1 g ∶ 15 mL时，桦褐孔菌中的多糖提取量最大（图1）。因此，选择提取时间20～40 min 、超声功率240～400 W、提取温度30～50 ℃、料液比1 g ∶ （10～20） mL为进一步优化。

2.2 桦褐孔菌多糖类物质提取的正交优化试验

通过正交试验确定桦褐孔菌多糖的最佳提取工艺。正交试验结果表明，影响桦褐孔菌多糖类物质提取率的因素主次顺序为D>A>B>C，即超声功率和超声时间对桦褐孔菌多糖提取效果影响相对较大，其次为提取温度、料液比的影响。综合以上条件，桦褐孔菌多糖的最佳提取条件为A2B2C1D3，即按1 g ∶ 20 mL的料液比在温度30 ℃下提取30 min，超声功率为480 W，乙醇浓度为30%进行多糖含量测定（表2）。

通过对正交试验结果进行方差分析，來分析各因素对多糖提取率的影响。结果表明，提取时间、功率、温度和料液比对提取率影响显著（表2）。

2.3 桦褐孔菌多糖的细胞毒理学评价

高浓度的药物对细胞具有一定的毒性，为了避免此情况的发生，本试验通过MTT法检测桦褐孔菌多糖对细胞存活率的影响，选取对细胞毒害作用较小的多糖作为给药剂。如表3所示，桦褐孔菌多糖浓度为6 mg/L时，细胞的存活率为9302%;浓度为60 mg/L时，细胞的存活率为80.04%;浓度为600 mg/L时，细胞的存活率为68.75%;浓度为6 000 mg/L时，细胞的存活率为38.06%;浓度为60 000 mg/L时，细胞的存活率为25.32%。随着桦褐孔菌多糖浓度的增加，HepG2细胞的死亡率也在升高，说明桦褐孔菌多糖对细胞有一定的毒害作用。当浓度在600 mg/L以下时，对细胞毒害作用相对小。因此，将桦褐孔菌多糖的给药浓度可设定在6～600 mg/L 之间的安全浓度范围内（表3）。

2.4 桦褐孔菌多糖对HepG2细胞TG含量的影响

为了减少高浓度的桦褐孔菌多糖对细胞的毒害作用，试验选取了600 mg/L以下的桦褐孔菌多糖浓度，测定不同浓度对HepG2细胞脂肪堆积模型TG含量的影响。表4所示，模型组与对照组相比，TG含量显著增加（P<0.05），表明HepG2细胞脂肪堆积模型成功建立[12]。60 mg/L桦褐孔菌多糖组与模型组相比，TG含量具有显著性差异（P<0.05）;600 mg/L桦褐孔菌多糖组与模型组相比，TG含量具有显著性差异（P<0.01），并随桦褐孔菌多糖浓度的升高，TG的清除率也逐渐升高，具有明显的剂量依赖性，其中高浓度组 600 mg/L 桦褐孔菌多糖对细胞内TG的清除效果最好，其清除率达到24.57%。

2.5 桦褐孔菌多糖减轻细胞内脂质堆积的作用

桦褐孔菌多糖对油红O染色的细胞形态学影响见图2，与对照组相比，模型组细胞内出现大量的红色脂滴，同时伴随相互融合现象，说明试验成功建立了细胞脂肪堆积模型[12]，并随着桦褐孔菌多糖浓度的提高，HepG2细胞内红色脂滴数目逐渐减少，且脂滴变小。在3个浓度桦褐孔菌多糖给药组中，低浓度给药组的作用效果不明显;与模型组相比，中浓度给药组对细胞内脂质堆积稍有改善，明显减轻了细胞内脂质相互融合的现象;高浓度给药组可明显减轻细胞内脂质堆积现象，且脂滴数目显著减少，这与陈静等研究人参多糖Rb1对HepG2细胞脂肪堆积影响结果[12]相似。本试验结果说明桦褐孔菌多糖对体外降脂有一定的作用效果。

3 讨论与结论

非酒精性脂肪肝病（NAFLD）的发病率呈现逐年上升的趋势，已经成为一种严重危害人类健康的世界性疾病。NAFLD是导致肝功能异常的主要原因，肝脏脂肪积聚是其典型特征，但并不能用单一的机制来解释其发病的机制。TG是NAFLD患者肝脏内蓄积的主要脂质，是由体内TG合成与转化失衡的结果[13]。

HepG2细胞已经被成功用于脂肪肝细胞模型的建立，且长链脂肪酸能够使HepG2细胞内形成明显的脂滴，进而引起细胞内脂肪的堆积。因为游离脂肪酸中含量最高的是油酸，所以选择油酸来诱导建立肝细胞脂肪堆积模型，是符合NAFLD形成的病理生理过程的[14]。因此，本试验采用以上诱导方法，在单因素的基础上通过正交试验得到桦褐孔菌多糖的最佳提取条件，将提取的桦褐孔菌多糖提取物作用于HepG2细胞，并选择NAFLD的常规检测指标来评价桦褐孔菌多糖对细胞内脂肪堆积的作用效果。试验结果表明，600 mg/L 桦褐孔菌多糖组的效果最显著，TG含量与模型组比较差异极显著（P<0.01），对细胞内TG的清除率可达

2457%，并且具有剂量依赖性。说明桦褐孔菌多糖提取物具有一定的清除细胞内脂肪堆积的作用，推测其在脂肪肝治疗方面也具有潜在的药用价值，但目前对于桦褐孔菌多糖降脂机制还不明确，具体的降脂机制还有待于进一步研究。