硫酸沙丁胺醇定量吸入气雾剂体外一致性评价方法*

肖梦琦，李苗

(1.湖北中医药大学药学院，武汉 430065；2.武汉药品医疗器械检验所，武汉 430075)

近年来,由于空气污染以及人口老龄化，哮喘及慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)发病率逐年升高。吸入制剂作为哮喘及COPD的急救用药，市场发展前景广阔，其质量关系到成千上万患者的生命安全。

硫酸沙丁胺醇是β2受体激动剂，能选择性作用于支气管平滑肌[1]并使之松弛，常用于治疗支气管哮喘、COPD[2]、肺气肿等疾病，常见的剂型有气雾剂、片剂[3]等。硫酸沙丁胺醇定量吸入气雾剂能够在哮喘急性发作时迅速缓解支气管痉挛[4]，为常用平喘药[5]，近年来在肺部疾病中的应用明显增加[6]，但由于吸入制剂技术含量高，研发难度大，国内生产企业较少。目前硫酸沙丁胺醇定量吸入气雾剂在国内的生产企业少，通过氟利昂替代的企业更少，临床大量使用进口药品且需求量大。因此开展吸入制剂的体外一致性评价方法研究，对该剂型的质量与疗效一致性评价工作尤为重要。

定量吸入气雾剂由驱动器、定量阀和加压铝罐组成。微细粒子空气动力学特性是定量吸入气雾剂质量控制的重要内容，利用安德森撞击器(Anderson Cascade Impactor，ACI)可以对微细粒子空气动力学特性进行评估，《美国药典》《英国药典》《欧洲药典》均收载了该方法，且相关实验操作步骤与《中华人民共和国药典》2015年版的描述大致相同。

ACI由8个收集板及相应的8个筛板(0-7级)、F级筛板、连接0级与人工喉锥部、人工喉和底座组成，从0级至7级筛板的孔径逐级减小，通过各级收集板收集的药物颗粒量来分析气雾剂中微细粒子的粒径分布情况。笔者在本实验比较两种硫酸沙丁胺醇定量吸入气雾剂的微细粒子空气动力学特性，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1仪器 Waters e2695高效液相色谱仪(美国Waters公司，配四元泵、在线脱气机、自动进样器、紫外检测器和Empower工作站)；Phenomenex Luna C18(2) 100A色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)； XS-105电子天平[梅特勒托利多仪器(上海)有限公司，感量：0.01 mg]；DFM 2000流量计、ACI(S)、HCP5真空泵(英国Copley公司)；科普利吸入制剂测试数据分析软件(Copley Inhaler Testing Date Analysis Software)；ACI滤膜(英国Copley公司，玻璃纤维滤膜，直径76 mm，型号：5240) ；SevenEasy pH计[梅特勒托利多仪器(上海)有限公司]。

1.2试药 硫酸沙丁胺醇对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100328-200703，含量：99.3%)；甲醇(Fisher Scientific，色谱纯)，无水乙醇、丙三醇、磷酸二氢钠、磷酸(国药集团化学试剂有限公司，批号：20170728，分析纯)；Brij35(聚氧乙烯月桂醚，SIGMA-ALDRICH公司，批号：MKBZ0816V，色谱纯)；超纯水。硫酸沙丁胺醇定量吸入气雾剂(A企业生产，批号：BB0549；规格：200揿，按沙丁胺醇计每揿100 μg，无氟利昂配方)；硫酸沙丁胺醇定量吸入气雾剂(B企业生产，批号：1605012，1607041，1608005，1703004，1704001；规格：200揿，按沙丁胺醇计每揿100 μg，无氟利昂配方)。

2 方法与结果

2.1色谱条件与系统适用性 HPLC法，使用Phenomenex Luna C18(2) 100A色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：磷酸盐缓冲液(0.08 mol·L-1磷酸二氢钠溶液，用磷酸调节pH值至3.10)-甲醇(85：15)；柱温35 ℃；样品温度15 ℃；检测波长：276 nm；流速1 mL·min-1；进样量100 μL。理论板数按沙丁胺醇峰计应不低于3000[7]。

2.2对照品溶液的制备 取硫酸沙丁胺醇对照品约10 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL溶液置20 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

2.3微细粒子空气动力学特性测定方法 称取Brij35 3 g，溶于无水乙醇20 mL，精密量取溶液2 mL，与甘油10 g充分混合均匀，制成甘油-Brij35混合液。用移液器吸取甘油-Brij35混合液70 μL，分别置于ACI装置中每一级收集板上，并用擦镜纸均匀涂布。

在ACI的F级放入合适的滤膜并用O型环固定。逐级安装ACI，L型管(人工喉)的末端与流量计相连，撞击器下方底座的出口与真空泵相连，应保证系统的气密性。开启真空泵，调节气体流量，使L型管进口处的气体流速为28.3 L·min-1(±5%)[8]，关闭真空泵，取下流量计，将合适的吸嘴适配器安装在L型管的末端，再将驱动器插入适配器内。将药罐插入另一个驱动器，振摇5 s后立即喷射1次，共弃去5揿，取下药罐，开启真空泵，将药罐振摇5 s后插入连在L型管上的驱动器中，立即喷射1次；取下药罐，振摇5 s，重新插入驱动器中，喷射第2次；重复此过程，共喷射10次。精密量取溶剂各10 mL，分别淋洗驱动器、0-7级各级的筛孔内壁和收集板、滤膜和O型环；精密量取20 mL溶剂润洗L型管的内壁，分别收集上述11份洗液，HPLC进样分析。取A企业样品3支、B企业样品每个批号各1支，按照上述实验步骤，每支进行2次实验。

2.4测定结果 两种硫酸沙丁胺醇定量吸入气雾剂的微细粒子空气动力学测定结果见表1。

2.5计算结果 利用Copley Inhaler Testing Date Analysis Software对微细粒子空气动力学测定结果进行计算和分析。由于两个企业样本均较少(n≤10)，且样本总体分布未知，故采用Wilcoxon Mann-WhitneyU秩和检验分析两个企业的样本，采查表法，利用两样本比较的秩和检验用T界值表判定两组总体是否有显著性差异。以P<0.05为差异有统计学意义。

2.5.1微细粒子分数(fine particle fraction，FPF) 药物颗粒直径>5 μm时被认为沉积于口咽部而无法进入肺部发挥作用[9-10]，故FPF按粒径不超过5 μm的药物颗粒占药物递送量的比例计算。两种硫酸沙丁胺醇定量吸入气雾剂的FPF计算结果见图1，表2。

根据表2结果，秩和检验统计量T=21，使用查表法，得单侧检验区间界值为27～75，T不在界值内，则P<0.05，B企业样品的FPF高于A企业样品。

2.5.2空气动力学质量中位直径(mass median aerodynamic diameter，MMAD)和几何标准偏差(geometric standard deviation，GSD) 两种硫酸沙丁胺醇定量吸入气雾剂MMAD计算结果见图2，表3；GSD计算结果见图3及表4。

表1 微细粒子空气动力学测定结果

Tab.1Determinationresultsofaerodynamicsoffineparticleμg·(10揿)-1

企业产品批号与瓶号驱动器L管0级1级2级3级4级5级6级7级滤膜A企业(批号:BB0549) 瓶1-1105.40606.0329.8017.0120.4073.56115.4156.988.711.451.04 瓶1-2124.23510.3630.5214.1619.1777.68124.0562.448.231.811.05 瓶2-1102.46529.0012.8611.8317.6668.90102.7543.195.660.970.70 瓶2-2135.71547.8139.7920.6024.3375.9999.1337.066.681.730.74 瓶3-1129.22453.1129.0117.5323.3985.35108.2043.117.031.750.80 瓶3-2133.23524.7433.3517.1721.5777.12103.1740.796.331.701.55B企业(批号:1605012) 1605012-157.44587.5212.289.50113.4773.48167.96107.2312.842.100.88 1605012-248.64599.0612.789.6712.3468.38150.8492.5112.502.170.90 1607041-178.26552.9612.848.1112.9074.17167.0587.9110.211.750.86 1607041-276.31581.2512.379.6911.9166.07151.5478.639.501.980.95 1608005-148.79617.497.086.8710.3469.53183.67109.7911.771.920.61 1608005-251.32642.528.137.5210.6368.45183.5886.6310.332.760.71 1704001-147.36543.4513.0410.0012.6478.57176.6090.0210.522.491.48 1704001-255.96584.237.856.659.6854.81142.5493.2911.362.951.17 1703004-183.50523.2321.0812.9818.3686.48146.6665.378.861.460.59 1703004-2115.60536.2610.848.7814.5975.21141.0568.339.142.691.29

图1 空气动力学微细粒子分数测定结果

Fig.1Resultsofaerodynamicsoffineparticlefraction(FPF)

根据表3、表4结果，秩和检验统计量分别为T=81与T=79.5，采用查表法，得单侧检验区间界值为27～75，T不在界值内，则P<0.05，A企业样品的MMAD与GSD均大于B企业样品，因此认为两种气雾剂微细粒子的粒径分布情况存在差异。

表2 FPF计算结果

Tab.2FPFresults%

2.5.3各级药物沉积量(μg)所占比例 从图4可知，与A企业样品比较，B企业样品药物颗粒在0～2级沉积量较低，在4～6级沉积量较高，且残留于驱动器的比例较小；二者药物颗粒在7级和滤膜上的沉积量较接近。

2.6数学模型 药物颗粒直径>5 μm时被认为沉积于口咽部而无法进入肺部发挥作用，直径<1 μm时又被呼出也不能发挥作用。因此以ACI撞击器2～6级在气流量为28.3 L·min-1时截止粒径为横坐标(X)，以2～6级的药物沉积量为纵坐标(Y)进行3次回归，

图2 空气动力学质量中位直径计算结果

图3 空气动力学微细粒子几何标准偏差计算结果

Fig.3GSDresults

建立了空气动力学微细粒子分布方程为Y=aX3+bX2+cX+K，R2≥0.98，各样品的拟合曲线见图5。

由表5和表6可见，A企业样品微细粒子在各层级药物沉积量的曲线与分布方程拟合程度较好，各条曲线相关系数均>0.98；B企业样品各层级药物沉积量曲线与分布方程拟合程度不够好，各条曲线的相关系数绝大部分<0.98且彼此差异较大。说明A企业样品的微细粒子层级分布存在规律，且测定结果差异较小，而B企业样品微细粒子层级分布规律性不强，结果较杂乱。

表3 空气动力学质量中位直径计算结果

Tab.3MMADresultsμm

表4 几何标准偏差(GSD)计算结果

使用空气动力学微细粒子分布方程可以表征MDI空气动力学微细粒子层级分布特征，通过进一步验证和完善，可能成为评价MDI仿制药与原研药空气动力学特性一致性的有效手段。

3 讨论

两种硫酸沙丁胺醇定量吸入气雾剂的微细粒子在粒径分布上存在差异。B企业样品的FPF高于A企业样品，但A企业样品的的微细粒子层级分布规律性强于B企业样品，可采用体外撞击实验和空气动力学微细粒子分布方程将样品继续与原研药进行比较研究，对本品空气动力学特性的一致性进行体外评价，为临床疗效的一致性评价提供参考。

将两种硫酸沙丁胺醇定量吸入气雾剂放入冰箱冷冻过夜后，取出铝罐，立即在罐的阀门上钻两个小孔排气。待罐内气体排尽后，割开铝罐，观察到明显不同：①A企业样品罐内留有白色药物粉末团块，未见液体，而B企业样品罐内留有类白色混悬液，取出后静置分层，可见两种样品的处方明显不同；②A企业样品的阀门处明显残留药物粉末，沾满阀门内壁，而B企业样品的阀门内仅残留极少的药物粉末，可能跟阀门的材料不同有关；③两种样品的阀门结构不同，A企业样品与B企业样品的阀门长度分别为8.0 mm和8.5 mm，阀门孔径基本相同，均约为1 mm；④两种样品的驱动器喷嘴孔径不同，A企业样品的驱动器喷嘴孔径大于B企业样品。上述不同之处可能也是导致两种样品的微细粒子分布不同的主要原因。

图4 各级药物沉积量比例

图5 空气动力学微细粒子分布曲线

表5 A企业样品空气动力学微细粒子分布方程

Tab.5DistributionequationofaerodynamicsfineparticlefromAcompany

瓶号(批号:BB0549)abckR2瓶1-17.49-83.4257-1290.985瓶1-28.16-90.9279-1400.983瓶2-16.53-73.8231-1220.994瓶2-25.95-68.2219-1170.998瓶3-16.55-75.4242-1290.999瓶3-26.37-72.7222-1230.999平均6.8-77.4242-1270.993RSD/%12.010.79.56.30.7

表6 B企业样品空气动力学微细粒子分布方程

Tab.6DistributionequationofaerodynamicsfineparticlefromBcompany

批号与瓶号abckR21605012-112.1-120379-1750.9161605012-210.7-116310-1580.9291607041-111.9-128381-1870.9411607041-210.8-117346-1690.9391608005-113.5-144419-1980.9081608005-213.3-143420-2100.9221704001-112.6-137406-2010.9461704001-210.4-111320-1450.8951703004-19.80-109334-1720.9841703004-29.60-106320-1610.971平均11.5-123364-1780.935RSD/%12.311.411.811.82.9

除微细粒子空气动力学特性之外，还可以从递送剂量均一性、每瓶总揿次、每揿重量、水分等方面进行深入研究，以更全面地评价两种硫酸沙丁胺醇定量吸入气雾剂质量的一致性。