TLR4沉默对高糖诱导胰岛微血管内皮细胞损伤的干预作用及机制

林雪波

【摘要】目的 探討Toll样受体-4（TLR4）沉默对高糖诱导胰岛微血管内皮细胞损伤的干预作用及机制。方法 利用 siRNA 沉默MS-1细胞中TLR4的表达，实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测TLR4 mRNA的表达，CCK-8 法检测细胞增殖，比色法测定一氧化氮水平，ELISA检测内皮素-1水平，羟胺法检测超氧化物歧化酶（SOD）活力，硫代巴比妥酸（TBA）法检测丙二醛水平，蛋白免疫印迹法检测TLR4、髓样分化因子88（MyD88）和核转录因子（NF）-κBp65蛋白的表达。将高糖处理的细胞分为高糖组及siRNA处理组（再分为siRNA-TLR4组及NC-TLR4组）进行上述指标的比较。结果 与高糖组比较，siRNA-TLR4组TLR4 mRNA的相对表达水平降低，细胞的增殖能力受抑制（P均<0.05）。此外，与高糖组比较，siRNA-TLR4组一氧化氮水平、SOD活力升高，内皮素-1、丙二醛水平下降（P均< 0.05）。与高糖组比较，siRNA-TLR4组TLR4、MyD88和NF-κBp65蛋白减少（P均< 0.05）。结论 沉默TLR4在MS-1细胞中的表达水平，减弱TLR4/NF-κB信号通路传递的炎症水平，间接降低氧化应激水平，从而改善高糖诱导的胰岛微血管内皮细胞损伤。

【关键词】Toll样受体-4;高糖;胰岛;微血管内皮细胞

【Abstract】Objective To evaluate the effect and mechanism of TLR4 silencing on high glucose-induced islet microvascular endothelial cell injury.  Methods The expression of TLR4 in the MS-1 cells was silenced by siRNA. The expression of TLR4 mRNA was detected by qRT-PCR. The cell proliferation was measured by CCK-8 assay. The nitric oxode（NO） level was determined by colorimetry. The endothelin （ET）-1 level was measured by ELISA. The superoxide dismutase （SOD） activity was detected by hydroxylamine method. The malondialdehyde （MDA） level was detected by thiobarbituric acid （TBA） method. The expression levels of TLR4， MyD88 and NF-κBp65 proteins were detected by Western blot. The cells treated with high glucose were divided into the high glucose and isRNA silencing groups （further divided into siRNA-TLR4 and NC-TLR4 groups）. Relevant parameters were statistically compared among different groups.  Results Compared with the high glucose group， the relative expression level of TLR4 mRNA was significantly down-regulated， and the proliferation ability of the cells was inhibited in the siRNA-TLR4 group （both P < 0.05）. In addition， compared with the high glucose group， the NO level and SOD activity were significantly increased， whereas the ET-1 and MDA levels were significantly decreased in the siRNA-TLR4 group （all P < 0.05）. Compared with the high glucose group， the expression levels of TLR4， MyD88 and NF-κBp65 proteins were significantly down-regulated in the siRNA-TLR4 group （all P < 0.05）.  Conclusions Silencing the expression of TLR4 in the MS-1 cells attenuates the inflammatory levels of the TLR4/NF-κB signaling pathways and indirectly reduces the oxidative stress levels， thereby mitigating the high glucose-induced islet microvascular endothelial cell damage.

【Key words】Toll-like receptor-4;High glucose;Islet;Microvascular endothelial cell

胰岛是高度血管化的人体器官，具有结构独特的微血管内皮细胞，与胰岛内分泌功能密切相关，能够快速响应葡萄糖和激素波动，但也易受不利因素的刺激，使胰岛的微血管完整性受损，并通过炎症细胞黏附和迁移，导致胰岛受到破坏[1]。有研究显示，长期高糖水平极易增加活性氧自由基水平，激活蛋白激酶C和辅酶I氧化酶系统，诱发胰岛微血管内皮氧化应激损伤[2]。Toll样受体（TLR）为识别受体的家族成员，对炎症信号通路的激活有重要的促进作用，同时还参与了宿主的炎症反应[3]。TLR4作为该家族成员，参与了胰岛细胞的慢性炎症和代谢紊乱的发生和进展[4]。但笔者见胰岛微血管内皮的相关研究较少。本研究重点讨论TLR4沉默对高糖诱导胰岛微血管内皮细胞损伤及功能的影响。

材料与方法

一、材料与试剂

小鼠胰岛微血管内皮细胞系MS-1细胞（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号GNM20）;TLR4 Rat siRNA（Origene公司，美国）;Lipofectamine? 2000 （Invitrogen 公司，美国）;BeyoFast? SYBR Green qPCR Mix （2X， Low ROX） （上海碧云天生物技术有限公司）;CCK-8细胞活力检测试剂盒（南京建成生物研究所）;超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛、一氧化氮、内皮素-1（南京建成生物研究所）;一抗TLR4、髓样分化因子88（MyD88）、核转录因子（NF）-κBp65，羊抗兔HRP标记的二抗（博士德生物工程有限公司）。

二、仪 器

倒置荧光显微镜（Nikon Corp）;酶标仪（美国，BioTek）;LightCycler? 96 全自动荧光定量PCR仪[罗氏诊断产品（上海）有限公司]。

三、方 法

1. 细胞培养及转染

MS-1细胞接种于含5.5 mmol/L葡萄糖、10%胎牛血清的DMEM培养基，于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养，胰蛋白酶消化、传代。依据预实验，分别设置5.5、15.0、25.0、35.0、45.0 mmol/L葡萄糖浓度进行96孔板细胞培养，依据细胞活力并最终选择葡萄糖浓度45.0 mmol/L为实验高糖浓度。采用葡萄糖浓度分别为5.5 mmol/L （正常组）、45.0 mmol/L的DMEM培养基培养细胞48 h。将45.0 mmol/L处理的细胞再分为：①高糖组，采用45.0 mmol/L葡萄糖DMEM培养基培养;②siRNA处理组，弃去培养基后继续加入无血清培养基。将lipofectamineTM 2000与无血清无双抗的培养基（1∶50）混合，静置5 min。将稀释的lipofectamineTM 2000和TLR4 siRNA干扰序列（5- ACUCAUUGGUUCCUUUAAGGG -3，siRNA-TLR4组）、未干扰序列（5- UCACACGUCAU UGUAGUGUGU -3，NC-TLR4组）混合、混匀（前期研究设计了3个siRNA进行比较，最终确定5- ACUCAUUGGUUCCUUUAAGGG -3效果最佳），继续静置20 min后加入预先采用无血清无双抗的培养基饥饿1 h的6孔板细胞中，培养6 h后，改换含45.0 mmol/L葡萄糖、10%胎牛血清新鲜培养基继续培养48 h。每个实验重复3次。

2. 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）

参照Trizol试剂说明书提取RNA，测定纯度。按照逆转录试剂盒说明书逆转录生成 cDNA。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。TLR4（AF110133.1）上游引物：5- CTCTGGGGAGGCACATCTTC -3，下游引物：5- CCCAGGTGAGCTGTAGCATT -3，产物大小208 bp;内参 GAPDH（NM_001289726.1）上游引物：5- CAGGTTGTCTCCTGCGACTT -3，下游引物：5- TATGGGGGTCTGGGATGGAA -3，产物大小282 bp。反应体系为20 μl，其中Beyo FastTM SYBR Green qPCR Mix （2×）10 μl，上游（3 μM）和下游（3 μM）2 μl，cDNA 2μl，PCR级高纯水6 μl。采用light cycleR 96 qRT-PCR仪，扩增条件：预变性95 ℃2 min;95 ℃变性15 s，60 ℃退火 30 s，60 ℃延伸 30 s，共40 个循环。数据采用2-△△Ct计算。

3. CCK-8细胞活力检测

取对数生长期细胞，调整密度为1×104个/ml接种于96孔板，每组设置3个复孔，参照上文设置各组，分别培养24、48、72 h，每孔加入CCK-810 μl，培养2 h，各孔细胞在450 nm测定吸光度A值，空白对照组调零，计算细胞活力。实验重复3次。4. siRNA对高糖损伤MS-1细胞内皮功能及SOD、丙二醛水平的影响  取对数生长期细胞，调整密度为1×104个/ml细胞接种于6孔板，每组设置3个复孔，上文设置各组，培养48 h。收集上清液，3 000 rpm离心10 min 去除细胞碎片，取上清冻存备用。用比色法测定一氧化氮水平，ELISA检测内皮素-1水平，羟胺法检测SOD活力，硫代巴比妥酸（TBA）法检测丙二醛水平。

5. 蛋白免疫印迹法检测TLR4、MyD88和NF-κB蛋白的表达

常规方法提取蛋白质，调整各样本蛋白总量，参照说明书行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，用5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗于4℃孵育过夜，孵育二抗，用Bio-Rad凝胶成像系统成像拍照，以β-actin为内参分析待測蛋白相对表达值。

四、统计学处理

采用SPSS 15.0处理数据，计量资料用表示，2组间比较采用t检验;多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。细胞活力的组间比较采用重复测量资料方差分析。α=0.05。

结果

一、高糖对MS-1细胞TLR4异常表达的影响

采用qRT-PCR检测MS-1细胞TLR4 mRNA的表达水平，结果显示，正常组TLR4 mRNA的表达水平（0.47±0.03）低于高糖处理组（1.21±0.58） （t =2.207，P = 0.046）。

二、siRNA对MS-1细胞中的TLR4 mRNA表达的抑制作用

高糖组TLR4 mRNA的相对表达量为1.19 ±0.55，NC-TLR4组为1.16±0.49，siRNA-TL4组为0.45±0.04，组间比较差异有统计学意义（F = 3.230，P = 0.036）。與高糖组比较，siRNA-TL4组TLR4 mRNA的表达水平降低（LSD-t = 2.324，P = 0.040）。

三、siRNA对MS-1细胞活力的影响

重复测量资料方差分析显示组别与时间的交互作用有统计学意义（F组别×时间=10.21，P=0.042），故分析单独效应。与高糖组相比，siRNA-TLR4组细胞活力增加（P < 0.05）。而高糖组细胞活力与NC-TLR4组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。

四、siRNA对高糖损伤MS-1细胞内皮功能及SOD、丙二醛水平的影响

与高糖组比较，siRNA-TLR4组一氧化氮水平、SOD活力升高（LSD-t值分别为3.674、11.286，P值分别为0.021、< 0.001）;与高糖组比较，siRNA-TLR4组内皮素-1、丙二醛水平下降（LSD-t值分别为3.933、24.225，P值分别为0.017、< 0.001）。而高糖组与NC-TLR4组的一氧化氮、内皮素-1、SOD和丙二醛比较差异无统计学意义（LSD-t值分别为0.134、0.228、1.381、1.253，P值分别为0.900、0.831、0.278、0.239）。

五、MS-1细胞TLR4、MyD88和NF-κB蛋白的表达

与高糖组比较，siRNA-TLR4组TLR4、MyD88和NF-κBp65蛋白降低（LSD-t值分别为5.068、9.127、5.302，P值分别为0.007、< 0.001、0.006）。而高糖组与NC-TLR4组比较，TLR4、MyD88和NF-κBp65蛋白水平差异均无统计学意义（LSD-t值分别为0.346、0.961、0.872，P值分别为0.746、0.391、0.412）。

讨论

长期处于高血糖状态可能降低β细胞活性的机制目前尚未完全明确，但可能涉及诱导内质网应激和氧化应激，导致胰岛内的促炎反应和细胞凋亡[5]。已有的研究重点在于改善高血糖从而调节胰岛功能，而有关胰岛微循环的研究很少。一些研究表明，高血糖容易导致微血管内皮细胞凋亡，其机制与细胞内活性氧自由基水平过高、脂质过氧化有关，并会引起线粒体功能障碍，活化氧化应激通路，加重组织损伤[6-7]。TLR4 属于TLR家族蛋白，能通过激活TLR信号通路中的关键接头分子MyD88传递上游信息并激活 NF-κB 等信号通路，诱发炎症反应，在机体的早期免疫应答中扮演着重要的角色[8]。

研究证实，高血糖易诱发氧化应激，产生大量的丙二醛，并损伤胰岛微血管内皮细胞[9]。而SOD作为重要的抗氧化酶，能通过清除超氧阴离子自由基阻断氧自由基对胰岛微血管内皮细胞的损伤[10]。体内一氧化氮主要通过一氧化氮合酶催化合成血管舒张因子，对免疫应激等具有重要的调节作用[11]。内皮素-1为一氧化氮的拮抗剂，可以维持血管基础张力，对心脑血管疾病的发生发挥重要作用[12]。因此，内皮素-1和 一氧化氮水平失衡将影响血管内皮细胞舒缩功能。在本研究中，高糖诱导的MS-1细胞的上清液中，丙二醛、内皮素-1水平上升，而SOD、一氧化氮水平下降，提示MS-1细胞存在氧化应激损伤。而通过siRNA沉默TLR4活性后，丙二醛、内皮素-1水平下降，而SOD、一氧化氮水平上升，提示此时MS-1细胞抗氧化能力增加，能够有效清除氧自由基，血管内皮细胞舒缩功能恢复。已有研究显示，TLR4能介导单核活性细胞活性氧的产生，而本研究显示的siRNA沉默TLR4后氧化应激水平的改变，可能与其有关，但具体机制尚待进一步研究。

高水平的氧化应激可以直接或间接激活TLR4/NF-κB信号通路级联反应，增加炎性因子表达水平，促进机体的炎症反应[13]。为了验证高糖所致的氧化应激水平与TLR4/NF-κB信号通路的关系，在本研究中笔者选择阻断TLR4活性，因为其为炎症信号通路的受体，是炎症信号级联放大的关键。笔者采用高糖干预MS-1细胞，siRNA转染MS-1细胞干扰TLR4的表达，并与未转染的高糖组比较，结果显示，TLR4沉默后，MyD88、NF-κBp65水平降低，与高糖组比较差异有统计学意义，说明沉默TLR4活性，可以通过降低关键接头分子MyD88水平，减弱传递到NF-κB的炎症信号，从而抑制NF-κB的活化，阻断TLR4/ MyD88/NF-κB信号通路的转导，降低炎性因子的表达水平，有效调控该信号通路，保护胰岛作用。

总之，siRNA沉默TLR4表达水平，减弱TLR4/NF-κB信号通路传递的炎症程度，间接降低氧化应激水平，从而改善高糖诱导胰岛微血管内皮细胞的损伤，为临床糖尿病的治疗提供新的靶点。

参 考 文 献

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（收稿日期：2018-10-30）

（本文编辑：洪悦民）