桂枝茯苓丸对慢性非细菌性前列腺炎大鼠的治疗作用及机制研究

陈盛镱　朱少平　胡利　谢作钢

【摘要】 目的探讨桂枝茯苓丸对慢性非细菌性前列腺炎（ CNP）大鼠模型的治疗作用，探讨其可能机制。方法将15只雄性SD大鼠分为生理盐水组、模型组和药物治疗组，每组各5只。适应性饲养后，生理盐水组大鼠前列腺的双侧腹叶予50μl生理盐水注射。模型组及药物治疗组大鼠前列腺的双侧腹叶予50μl的5%甲醛溶液注射诱导前列腺炎症，药物治疗组在诱发前列腺炎前2d开始以0.5 9/（kg·d）的桂枝茯苓丸悬液灌胃给药，连续给药30 d后进行膀胱测压，测压后采集大鼠的膀胱和前列腺组织，使用实时荧光定量PCR法检测神经生长因子（NCF）、三磷酸腺苷受体（ P2X2）、瞬时受体电位通道Al（ TRPAI）、TNF-α、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、环氧酶2（ COX2）和雌激素受体（ER） mRNA的相对表达并进行组织学分析。结果 与生理盐水组大鼠相比，模型组大鼠排尿间隔较短、每周期无排尿性收缩次数较多、最大排尿压较低、残余尿量较少（P均> 0.05），药物治疗组大鼠上述指标均较模型组改善（P均<0.05）。模型组大鼠的前列腺组织可见肥大细胞和淋巴细胞的基质浸润和不规则形状的腺泡，药物治疗组大鼠的前列腺组织中未见上述改变。与生理盐水组相比，模型组大鼠膀胱黏膜中NCF、P2X2和TRPAI以及前列腺腹叶中TNF-α、iNOS、COX2的mRNA相对表达均较高（P均<0.05）;而药物治疗组上述mRNA相对表达均低于模型组（P均<0.05）。模型组大鼠ER β mRNA相对表达、ERβ /ERα低于生理盐水组，ERα mRNA相对表达高于生理盐水组（P均<0.05）;而药物治疗组大鼠ERβmRNA相对表达、ERβ /ERα高于模型组，ERα mRNA相对表达低于模型组（P均<0.05）。大鼠上皮细胞核和前列腺腹叶细胞ERB染色在生理盐水组中呈阳性，在模型组中染色减弱，在药物治疗组中亦呈阳性。结论桂枝茯苓丸可能通过激活ERβ，使前列腺的ERβ /ERα的表达比升高，改善前列腺炎症及CNP刺激性膀胱过度活动。

【关键词】 前列腺;炎症;雌激素受体;桂枝茯苓丸

前列腺炎分为急性和慢性前列腺炎，慢性非细菌性前列腺炎（CNP）是前列腺炎中最常见的类型，占慢性前列腺炎的90%以上[1]。据报道，非细菌性前列腺炎与BPH和男性下尿路症状（IUTS）的发展有关[2]。研究显示，前列腺活组织检查（活检）标本中BPH体积和国际前列腺症状评分（IPSS）有关，且严重的炎症与高IPSS相关[3-4]。前列腺炎症可能是BPH和男性LUTS的重要病因之一。另有研究显示，雌激素通过2种不同的雌激素受体（ ER）即ERα和ERβ调节组织炎症[5]。ERβ的抗炎作用也在各种动物疾病模型中发挥作用，如脑脊髓炎、炎症性肠病、膀胱炎和皮肤病。桂枝茯苓丸源于张仲景《金匮要略·妇人妊娠病脉并治》，由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、白芍组成，原为针对妊娠期妇女化淤的方剂。近年研究显示，其应用己不限于妇科疾病，对治疗CNP同样有效[6]。因此，本研究利用前列腺内注射甲醛诱导CNP大鼠模型来研究桂枝茯苓丸是否可以通过调节ERβ减轻膀胱过度活动，现报告如下。

材料与方法

一、实验动物

SPF级健康成年雄性SD大鼠15只，8周龄，体质量200 - 250g，由温州医科大学实验动物中心提供[实验动物许可证SCXK（浙）2015-0001]，于恒定室温下，12 h循环照明的环境中自适应饲养7d，期间自由摄食与饮水。本研究所有的实验操作均符合中国实验动物管理规定，研究方案经温州医科大学实验动物管理和伦理委员会批准。

二、主要试剂及仪器

主要试剂包括：桂枝茯苓丸（成都九芝堂金鼎药业有限公司），DAB显色液（北京中杉金桥生物技术有限公司），0.01 mmol/L磷酸盐缓冲液（PBS，北京中杉金桥生物技术有限公司），S-P免疫组织化学染色（免疫组化）检测试剂（北京中杉金桥公司）。主要仪器包括：Leica CM2500显微成像系统，OlympusCX21显微镜，SHIMADZU电子分析天平（万分一），莱卡石蜡切片机，匀浆器（江苏金坛市晶玻实验仪器厂），旋涡混合器（北京北德科学器材有限公司），Hitachi-CR2082高速冷冻离心机，GZX-9070电热恒温鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。

三、方法

1.分组

经过适应性饲养后将大鼠分生理盐水组、模型组、药物治疗组，每组各5只。生理盐水组大鼠前列腺的双侧腹叶予50μl生理盐水注射。模型组及药物治疗组大鼠前列腺的双侧腹叶予50μl的5%甲醛溶液注射誘导前列腺炎症[7]。药物治疗组大鼠从甲醛注射前2d开始，持续30 d予桂枝茯苓丸及生理盐水制成的混悬液0.5 g/（kg.d）灌胃，模型组大鼠在相应时间予等体积生理盐水灌胃。

2.膀胱测压

在大鼠前列腺内注射50μl 50%甲醛溶液或生理盐水28 d后行膀胱测压。测定前2d用异氟烷麻醉大鼠，将PE-50聚乙烯导管从膀胱壁插入膀胱中，并且在膀胱测压当日将导管通过三通旋塞连接到压力传感器和注射泵上，以0.05 ml/min的速度将生理盐水通过注射泵注入膀胱内，并在Power-LabTM数据采集分析系统上采集数据记录膀胱内压。大鼠适应环境至少2h后，分别记录3次排尿周期以评估排尿间隔（ VI）、最大排尿压（MVP）和无排尿性收缩次数（ NVC）。在3次排尿循环之后，停止注射生理盐水并撤回膀胱内导管，随后通过腹壁手动压缩膀胱测量排空后残余尿量（ RV）。

3.组织病理学检查

膀胱测压后，用颈椎脱臼法处死大鼠，下腹部正中切口，直达腹腔，取前列腺腹叶和膀胱组织进行组织学分析，用10%甲醛溶液固定24 h，石蜡包埋，切片，苏木素一伊红（HE）染色评估炎症程度。前列腺的其余部分用于免疫组化。将石蜡切片脱蜡、梯度乙醇水化，在105℃下用高压灭菌器以10 mmol/L柠檬酸钠缓冲液修复抗原，冷却后PBS冲洗，3%过氧化氢中孵育10 min消除过氧化物酶活性，蒸馏水和PBS冲洗。滴加10%正常山羊血清封闭30 min。滴加ERβ抗体在室温下孵育1h。PBS洗涤，滴加HRP标记的聚合物抗兔抗体温育30 min。PBS洗涤，用DAB显色液显色2-5 min，苏木素复染。

4.实时荧光定量PCR

处死大鼠后打开腹腔，取前列腺腹侧叶和一部分膀胱黏膜组织至新的1.5 ml EP管中，用玻璃棒研磨，加入Trizol l ml充分振荡混匀，加入氯仿0.2 ml，盖紧后用力摇15 s，15 - 30℃孵育2 -3 min，4℃12 000×g离心15 min，取上清液，根据说明书使用Trizol试剂提取总RNA;使用ThermoScript RT-PCR系统将总RNA（l mg）合成为模板DNA。引物分别为ERβ（NM_012754）、ERa（NM_012689）、TNF-α（NM_012675）、 诱导型一氧化氮合酶（iNOS，XM_003750865）、环氧酶2（COX2，NM_017008）、三磷酸腺苷受体（P2X2，NM_207608）、瞬时受体电位通道A1（TRPAI，XM_008769306）、神经生长因子（NGF，NM_001277055）和内参基因GAPDH（ NM_017008）。其中引物ERB、ERα、TNF-α、COX2、NGF和GAPDH由QIAGEN（ QuantiTect Primers）预先设计和验证，其他引物由Primer 3软件设计（表1）。PCR反应体系50μl，反应条件为：94℃30 s、55℃30 s、72℃60 s，最后72℃延伸7 mm，共30个循环。SYBR Green法荧光定量PCR分析各基因的表达并利用2-△△ CT法分析相应的数据，取每个靶基因与GAPDH的表达比值为相对表达的结果。

四、统计学处理

使用SPSS 17.0分析数据。计量数据以x±s表示，多组间比较采用方差分析，多重比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、3组大鼠的膀胱测压结果比较

在前列腺内注射50 μl 5%甲醛溶液或生理盐水28 d后3组大鼠的排尿间隔（F=23.895，P< 0.001）、每排尿周期无排尿性收缩次数（F=38.224，P<0.001）、最大排尿压（F=24.629，P< 0.001）、残余尿量（F=10.236，P=0.002）比较差异有统计学意义。与生理盐水组大鼠相比，模型组大鼠排尿间隔较短、每周期无排尿性收缩次数较多、最大排尿压较低、残余尿量较少（P均> 0.05），药物治疗组大鼠上述指标均较模型组改善（P均< 0.05），见图1。

二、3组大鼠的组织病理学比较

生理盐水组大鼠前列腺组织的腹侧叶中有规则形状的腺泡和完整的基底膜（图2A），模型组大鼠的前列腺组织可见肥大细胞和淋巴细胞的基质浸润和不规则形状的腺泡（图2B），然而，药物治疗组大鼠的前列腺组织中未见上述改变（图2C）。3组大鼠的膀胱组织均无炎症细胞积聚或上皮形成改变（图2D-F）。

三、3组大鼠膀胱黏膜中NGF、P2X2和IRPA1mRNA相对表达比较

生理盐水组、模型组、药物治疗组大鼠膀胱黏膜中NGF（F=43.648，P<0.001）、P2X2（F= 37.017， P<0.001）和TRPAI （F= 34.572，P<0.001）的mRNA相对表达差异均有统计学意义，模型组大鼠膀胱黏膜中NCF、P2X2和TRPA1的mRNA相对表达均高于生理盐水组（P均<0.05），药物治疗组大鼠膀胱黏膜中NGF、P2X2和TRPAI的mRNA相对表达均低于模型组（P均<0.05），见图3。

四、3组大鼠前列腺腹叶中TNF-α、iNOS、COX2、ERa、ERβ mRNA相对表达比较

3组大鼠前列腺腹叶中TNF-α（F=18.580，P<0.001）、iNOS（F=15.690，P<0.001）、COX2（F= 16.345，P=0.004）、ERa （F= 26.844，P<0.001）、ER3（F=20.657，P<0.001） mRNA相对表达和ERB /ERa（F=12.062，P=0.001）比较差异均有统计学意义。与生理盐水组相比，模型组大鼠前列腺腹叶中TNF-α、iNOS、COX2、ERa、ERβ的mRNA相对表达均较高（P均<0.05），而药物治疗组的上述基因mRNA相对表达均低于模型组（P<0.05）。模型组大鼠ER[3 mRNA相对表达低于生理盐水组，ERα mRNA相对表达高于生理盐水组（P均< 0.05），而药物治疗组大鼠ER3 mRNA相对表达、ER3/ERa高于模型组，ERα mRNA相对表达低于模型组（P均<0.05），见图4。

五、3组大鼠的免疫组化

在生理盐水组大鼠中，ERβ在上皮细胞核和前列腺组织腹叶的细胞质中观察到阳性染色（图5A）。在模型组大鼠中，不规则形状腺泡的上皮细胞核中ERβ染色减弱，前列腺腹叶中可见炎性改变（图5B）。在药物治疗组大鼠中ER3表达恢复到生理盐水组大鼠的水平（图SC）。

讨论

桂枝茯苓丸由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、白芍组成，主药桂枝辛甘而温、温通经脉，以除淤滞，辅药桃仁味苦甘平，活血化淤，丹皮、白芍味苦微寒，既能活血散淤，又可凉血以清淤热，白芍兼能缓急止痛。茯苓甘淡性平，利水渗湿以祛痰，并能健脾益气。该方寒温并用，温通祛淤而无耗伤阴血之弊，祛邪以固本，下淤不伤正。该药原用于妇科，在子宫肌瘤和卵巢囊肿等有较好的治疗效果，也有助女性调理月经。近年多项研究显示，其应用己不限于妇科疾病，凡辨证属于血淤湿滞者的各科疾病，均可加减用之且有效，这也是中医学中“异病同治”的治法和优势。有研究报道，桂枝茯苓丸可降低血清雌激素受体（ ER）水平，但存在研究的樣本尚少，未能阐明治疗机制[8]。

CNP患者常表现出膀胱刺激症状，如尿频或尿急[9]。本研究中，与生理盐水组相比，模型组大鼠排尿间隔较短、每周期无排尿性收缩次数较多、最大排尿压较低、残余尿量较少，表明CNP大鼠存在膀胱过度活动。NGF是膀胱过度活动症（ OAB）的生物标志物之一，其在患者的尿液中浓度很高[10]。本研究还检测了P2X2和TRPAI受体的表达，这些主要在C纤维传人途径中表达的受体，已被认为是OAB或膀胱炎症中的病理生理机制[11]。因此，本研究中上述基因相对表达在膀胱中的上调可能导致CNP后膀胱活动增强[12]。

在模型组大鼠中，前列腺组织中ERα和炎症相关基因如TNF-α、iNOS和COX2上调。然而，用桂枝茯苓丸治疗可减少膀胱过度活动和下调ERα、TNF-α、iNOS和COX2的mRNA表达，并恢复ERβ的mRNA表达[13]。TNF-α是一种促炎细胞因子，由巨噬细胞响应组织损伤而产生，COX2和iNOS表达的上调诱导PGE2和NO的产生[14]。这些基因在组织炎症进展中发挥重要作用。

虽然已知雌激素参与调节前列腺生长，但也对前列腺上皮有不良影响，如异常增生、炎症和癌变等[15]。研究显示雌激素对前列腺的这些作用与ERα的激活有关[15-16]。本研究使用大鼠CNP模型研究ERα和ERβ表达的变化，通过注射甲醛诱导大鼠前列腺炎，可观察到ERα的mRNA表达增加，而ERβ的表达下调。因此，甲醛诱导的前列腺炎可能会增加ERα与ERβ的相对表达水平，进而可能导致慢性前列腺炎症。一项BPH组织的研究也显示，与正常前列腺组织相比，前列腺上皮细胞中ERα表达水平增加，表明ERα的激活是BPH相关增殖的重要机制[17]。

本研究未对前列腺炎症表型进行定量分析，包括前列腺炎或桂枝茯苓丸治疗后异常腺泡的发生率，而主要关注膀胱表型，如膀胱过度活动和前列腺炎症后膀胱的分子变化。因此，需要进一步研究验证ER介导的前列腺炎调节机制。

总之，炎症相关基因表达的增加和ERβ/ERα的降低可能导致动物模型中CNP和膀胱过度活动的发生。而桂枝茯苓丸给药治疗可以升高ERβ/ERα，并抑制膀胱过度活动和前列腺炎症。因此，ERβ刺激可能成为治疗前列腺炎症和BPH患者中刺激性膀胱症的治疗策略。

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