无花果酒的发酵工艺及其抗氧化活性分析

马艳弘，金秋琼，崔晋，曹培杰，田丽敏，黄开红

(1.江苏省农业科学院 农产品加工研究所，江苏 南京 210014；2.苏州西山国家现代农业示范园区有限责任公司，江苏 苏州 215111)

无花果(FicuscaricaL.)隶属桑科无花果属，其果汁香气浓郁、酸甜适口[1]，既含有丰富的维生素、矿质元素、氨基酸等，还含有多酚、黄酮、活性多糖、超氧化物歧化酶(SOD)、呋喃香豆素内酯等生物活性物质[2，3]，具有免疫调节、保护心血管、降血脂、抗衰老等多重药理保健功效[4～6]，具有广阔的市场发展前景。

由于无花果不耐储运，每年都有大量果实在盛果期烂在田头、摊位，给果农造成很大的经济损失，严重制约了其产业发展。在无花果加工领域，果酒加工技术途径低碳高效、几乎可保留其所有的营养成分，是最有发展前景的加工技术途径。邓星星等通过ITS序列分析，鉴定出菌株SUYX-03属于酵母属中的酿酒酵母，由发酵试验得出该酵母菌是适合无花果果酒制作的优良的酿酒酵母[7]；蒋成等通过主成分分析研究不同酵母与有机酸之间的相关性，发现与菌株KD密切相关的有机酸种类最多[8]；JustynaPotka-Wasylka等通过选择参数包括pH值、酒精含量和发酵温度的应用程序对无花果酒的发酵程序进行了最优化分析与评估[9]。迄今为止，多数有关无花果酒的研究仍主要集中在简单加工方面，相关产业化生产工艺、活性因子检测及抗氧化活性等方面仍亟需进一步深入研究。本研究通过酵母菌发酵制备无花果酒，并通过单因素试验和响应面分析法优化无花果酒的最佳发酵工艺并考察维生素C、多酚、黄酮等主要的功能因子及其体外抗氧化活性，旨在为无花果酒的产业化生产提供理论依据和技术参考。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

布莱瑞克无花果：由苏州西山国家农业示范有限责任公司提供，品种为“玛斯义陶芬”，八成熟。

酿酒酵母：酵母菌RV171、RV002、BV181、PHYT，安琪酵母股份有限公司。

纤维素酶(活力≥10 000 U·mg-1)、果胶酶(活力≥30 000 U·g-1)：合肥Biosharp生物科技有限公司；福林酚：上海源叶生物科技有限公司；DPPH：南京藤春生物科技发展有限公司；维生素C检测试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

电子天平(PL303型)：梅特勒-托利多(上海)有限公司；打浆机(MJ-BL15U11型)：广东美的生活电器制造有限公司；电热恒温水浴锅(DK-8D型)：上海精宏实验设备有限公司；紫外可见分光光度计(D-8型)：上海奥析科学仪器有限公司；漩涡混合仪(XW-80 A型)：海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 无花果酒制备工艺

无花果清洗干净后用打浆机破碎榨汁，加入1.56%的纤维素酶和0.28%的果胶酶，于53 ℃条件下酶解90 min，酶解结束后将果浆糖度调节至20%，再添加SO2(K2S2O5)混合均匀，然后接种酿酒酵母发酵剂保温发酵，发酵结束后用板框压滤机进行渣液分离，清酒经澄清处理后依次经硅藻土过滤、膜过滤后灌装，即为成品。

1.3.2 菌种的活化

将酿酒干酵母粉按照1：20(g·mL-1)的质量体积比与4%的葡萄糖溶液混合均匀，在35～37 ℃条件下保温培养20～30 min，即得酵母菌发酵剂。

1.3.3 酵母菌的选择

无花果经打浆酶解后，添加80 mg·kg-1SO2，再按照0.04%的接种量分别接种活化的酵母菌RV171、RV002、BV181、PHYT，在25 ℃条件下发酵10 d，经渣液分离、澄清处理后检测无花果酒的酒精度和维生素C含量，根据结果确定适宜的发酵菌种。

1.3.4 无花果酒发酵工艺单因素试验

在确定适宜发酵菌种的基础上，分别考察酵母接种量(0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%)，SO2添加量(25、45、65、85、105、125 mg·kg-1)，发酵温度(24、26、28、30、32、34 ℃)，发酵时间(0、2、4、6、8、10`、12 d)对无花果酒酒精度的影响，根据结果确定适宜的发酵条件。

1.3.5 无花果酒发酵工艺响应面优化试验

根据单因素试验结果，以SO2添加量、酿酒酵母接种量、发酵温度、发酵时间为试验因素，以酒精度为响应值，采用Box-benhnken中心组合设计，根据Design-Expert 8.05软件优化最佳发酵工艺条件。

1.3.6 无花果酒体外抗氧化活性检测

分别取1 mL 无花果酒液，参考马艳弘等[10]的方法加入不同反应剂，根据517 nm处吸光度计算DPPH自由基清除率；按照徐静珠等[11]的方法加入不同反应剂，根据其550 nm处的吸光值计算羟自由基清除率。

1.3.7 指标检测

酒精度参照GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定；总多酚含量采用福林-酚法测定[9]，标准曲线回归方程为：y=0.010 9x+0.002 1(R2=0.999 1)；总黄酮采用芦丁-AlNO3法测定[12，13]，标准曲线方程为：y=9.74x-0.005 3(R2=0.999 4)：维生素C按照南京建成生物工程研究所维生素C测定试剂盒说明书进行。

1.4 统计分析

利用SPSS18.0和Design-Expert 8.05数据处理软件进行数据处理分析。

2 结果与分析

2.1 酿酒酵母菌种的确定

考察不同酿酒酵母对无花果酒的酒精度和维生素C含量的影响，从图1可以得出，采用酿酒酵母RV171发酵的无花果酒中酒精度最高，达12.8% vol；维生素C含量也最高，达173.52 mg·L-1，其次为酵母菌PHYT，酒精度和维生素C含量分别11.5% vol和173.24 mg·L-1，酿酒酵母RV818发酵的无花果酒其酒精度和维生素C含量均最低。因此确定酵母菌RV171为最适宜的发酵菌种。

图1 不同酵母菌对无花果酒酒酒精度和维生素C含量的影响Fig.1 Effect of yeast type on alcohol and VC contents of fig wine

2.2 发酵工艺单因素试验结果与分析

2.2.1 酿酒酵母接种量对无花果酒酒精度的影响

如图2可知，随着干酵母菌接种量的提高，酒精度升高，到接种量为0.03%～0.04%时，无花果酒的酒精度达到最高(11.4%vol)；接种量大于0.04%，则酒精度又略有下降。这是由于若接种量小，果汁中的糖不能完全被酵母利用转化，致使酒精度较低；若接种量过大，酵母菌大量生长消耗了果汁中的糖分，致使产酒精的底物浓度降低从而导致了酒精度的减小。由此确定干酵母菌的适宜接种量为0.03%。

图2 酵母菌接种量对无花果酒酒精度的影响Fig.2 Effect of yeast inoculum amount on alcohol content of fig wine

2.2.2 SO2添加量对无花果酒酒精度的影响

由图3可知，随着SO2添加量的增加，无花果酒的酒精度呈先升高后下降的趋势，当SO2添加量为85 mg·kg-1时，酒精度达最大。这是由于SO2添加量低时会造成杂菌污染，消耗部分糖份从而造成酒精度的偏低，SO2添加量过高，则又会抑制酵母菌的生长从而导致发酵力下降、酒精度降低。综合考虑，确定SO2的最适添加量为85 mg·kg-1。

图3 SO2添加量对无花果酒酒精度的影响Fig.3 Effect of SO2 concentration on alcohol content of fig wine

2.2.3 发酵温度对无花果酒酒精度的影响

由图4可知，在所设温度范围内，随着发酵温度的提高，无花果酒的酒精度变化趋势是先升高后降低，当发酵温度为28 ℃时，酒精度最高；这是由于温度影响到酵母菌的生长，温度低时，酵母菌发酵速度慢，产酒精度能力低，但温度过高，酵母菌衰老速度加快，最终导致了产酒精能力降低。由此确定28 ℃为适宜的发酵温度。

图4 发酵温度对无花果酒酒精度的影响Fig.4 Effects of fermentation temperature on alcohol content of fig wine

2.2.4 发酵时间对无花果酒酒精度的影响

图5可知，在所设温度范围内，随着发酵温度的提高，无花果酒的酒精度变化趋势是先升高最后趋于平缓。当发酵时间为8 d时，酒精度达到最高值；大于8 d，酒精度则趋于平缓。这是由于发酵8 d后，无花果汁中的糖分几乎消耗殆尽，因而导致酒精含量的稳定。由此确定8 d为适宜的发酵温度。

2.3 无花果酒发酵条件的响应面优化结果与分析

2.3.1 响应面试验设计与结果分析

在单因素试验基础上，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理优化无花果酒发酵条件。其试验设计方案与结果见表1。

由表2还可知：因素A，D，B对无花果酒精度的影响显著(P<0.01或P<0.05)，C对酒精度的影响不显著(P>0.05)，4个因素对响应值的影响程度大小依次为D>A>B>C；交互项AB，AC，AD以及二次项A2，B2，C2，D2对酒精度的影响显著(P<0．01或P<0．05)。说明4个因素能不同程度的对响应值产生影响，本试验设计的因素选择科学合理。

表2 方差分析表Table 2 Analysis of variance for the regression model

续表2

注：*表示P<0.05,影响显著；**表示P<0.01,影响极显著；N表示P>0.05,影响不显著。
Note:*P<0.05,striking contrast;**P<0.01,Extremely striking contrast

2.3.2 响应面分析与优化

根据响应面曲面的陡度程度分析任意2个因素取零点水平时，其他两个因素的交互作用对无花果酒酒精度的影响程度，曲面越陡，表明变量对酒精度的影响越大[16]。由图6可见，在3个交互项中，任何2个交互因素的响应面都存在最高点，酿酒干酵母接种量(A)与SO2添加量(B)、酿酒干酵母接种量(A)与发酵温度(C)、酿酒干酵母接种量(A)与发酵天数(D)的响应面曲面坡度均较陡峭，其交互作用对无花果酒精度的影响也较为显著。

2.3.3 发酵条件最优条件及验证试验

通过软件分析优化，得到的最优发酵工艺参数：酿酒干酵母接种量0.03 %、焦亚硫酸钾添加量82.89 mg·kg-1、发酵温度28.02 ℃、发酵天数8.44 d，此条件下无花果果酒的理论酒精度为12.21 %vol。为了操作方便，修正发酵参数为：酿酒干酵母接种量0.03 %，焦亚硫酸钾添加量85 mg·kg-1，发酵温度28 ℃，发酵天数8 d，进行3次平行试验，得出无花果果酒的实际酒精度为12.20% vol，与理论预测值吻合程度很高，说明该试验结果稳定、可靠，该模型可以较好地预测无花果酒发酵条件与酒精度的关系。

2.4 无花果酒抗氧化活性分析

在最佳发酵工艺条件下进行试验，检测无花果汁发酵前和发酵结束后的酒液中的主要抗氧化活性成分和自由基清除率，结果如表3所示。由表3可见，与发酵前相比，·OH清除率无显著差异(P>0.05)，DPPH自由基清除率显著提高(P<0.05)。说明酒精发酵可以显著提高无花果的生物活性物质含量和自由基清除能力，无花果酒比无花果汁具有更强的抗氧化能力和生物保健功能。

图6 各因素交互作用影响无花果酒酒精度的响应面图Fig.6 Response surface plot showing the effects of yeast inoculum amount,SO2 concentration,fermentation temperature,and time on alcohol content of fig wine

表3 无花果酒抗氧化活性成分和自由基清除能力检测结果Table 3 Detectionresults of antioxidant components and free radical scavenging activity in fig wine

注：a表示差异显著(P<0.05)，A表示差异极显著(P<0.01)。
Note:a indicates significant difference(P<0.05);A indicates that the difference is extremely significant(P<0.01).

2.5 无花果酒理化指标分析

在最佳发酵工艺条件下进行实验，检测无花果汁发酵前和发酵结束后无花果酒中的理化指标，结果见表4。由表4可见，无花果酒中的维生素C、总酚、黄酮含量分别比发酵前提高了4倍、1.27倍、1.64倍。这表明，相较于无花果汁，无花果酒具有更高的营养价值，其原因可能在于发酵过程中产生了这些物质。

表4 无花果酒理化指标Table 4 Physicochemical indices of fig wine

注：a表示差异显著(P<0.05)，A表示差异极显著(P<0.01)。
Note:a indicates significant difference(P<0.05);A indicates that the difference is extremely significant(P<0.01).

3 讨论与结论

影响果酒风味与品质的因素很多，酿酒用果实品种、酿酒酵母的种类与发酵性能、工艺条件均能影响果酒的口感和风味[17～19]。国内果酒大多采用葡萄酒酿酒酵母发酵而成，缺乏典型性和专一性，因而很难在不同类型果酒品质提升上有所突破，本研究通过考察不同酵母菌对无花果酒酒精度和维生素C含量的影响，确定酿酒酵母RV171为适宜的发酵菌种；通过单因素试验和响应面分析法，建立了发酵条件为自变量、酒精度为响应值的数学模型：Y=12.10+0.27A-0.12B+0.058C+0.40D-0.43AB-0.27AC+0.25AD-0.12BC+0.075BD+0.075CD-0.54A2-0.53B2-0.42C2-0.64D2。优化得到了无花果酒的最佳发酵工艺参数为：酿酒干酵母接种量0.03 %，SO2添加量85 mg·kg-1，发酵温度28 ℃，发酵天数8 d，酒精度为12.2 %vol，与预测值吻合程度很高，表明该模型科学合理，可以对无花果酒的产业化生产起到很好的指导作用。

多酚、黄酮等化合物是葡萄酒、苹果酒等果酒中重要的组成成分，参与或决定酒的色泽、香气、稳定性、收敛性等，同时也是果酒发挥抗氧化、抗衰老等保健功能的物质基础[20～22]。本研究检测了最佳工艺条件下生产的无花果酒中维生素C、总酚、黄酮等主要抗氧化成分，并评估了其自由基清除能力，结果表明无花果酒对DPPH自由基的清除率达75.32%，对·OH的清除能力达342.93 U·mL-1，酒中维生素C、总酚、黄酮含量分别比发酵前提高了4倍、1.27倍、1.64倍。可见酒精发酵过程能够显著提高无花果汁的抗氧化活性，无花果酒具有比无花果汁更强的营养保健功能，可以作为一种抗氧化剂和自由基清除剂，具有广阔的市场开发前景。