人参方对血虚小鼠抗疲劳作用及其机制研究

2019-07-03黄鑫陈雪王恩鹏陈长宝刘淑莹王文清

特产研究 2019年2期

黄鑫，陈雪，王恩鹏，陈长宝，刘淑莹,2※，王文清

（1.长春中医药大学吉林省人参科学研究院，长春 130117；2.中国科学院长春应用化学研究所长春质谱中心，长春 130022；3.黑龙江飞鹤乳业有限公司，黑龙江齐齐哈尔 755258）

疲劳是机体生理过程不能维持其机能在某一特定的水平或者不能维持运动强度。抗疲劳就是延缓疲劳的产生或者加速疲劳的消除[1]。疲劳的评价方法主要有耐力试验和生化指标检测。测定机体持续运动至力竭的时间可以反映机体的耐力[2]。机体生化的改变导致疲劳感觉发生，因此，可用与疲劳相关的生化指标来研究疲劳的发生和发展过程变化[3,4]。人参为滋补类名贵药材，具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津养血、安神益智等功效。现代药理研究证实，人参具有抗疲劳作用[5-7]。本试验选择人参、茯苓、莲子、桂圆等药、食同源中药组方，研究其对血虚小鼠的抗疲劳作用，并探讨其抗疲劳的作用机制。

1 仪器与材料

1.1 实验动物

昆明种小鼠75只，15～20g，雄性，由辽宁长生生物技术有限公司提供，合格证号：SCXK-（辽）2015-0001

1.2 药品与试剂

人参、茯苓、莲子、桂圆超微粉（吉林省怡生对外贸易有限公司，以一定比例混合均匀后备用）；环磷酰胺（国药准字H32020857，江苏盛迪医药有限公司）；尿素氮试剂盒（C013-2）、肝糖原试剂盒（A043）、乳酸脱氢酶试剂盒（A020-1）、ATP酶试剂盒（A016-2）、血乳酸试剂盒（A019-1）（南京建成生物工程研究所）；羧甲基纤维素钠（9004-32-4）（天津光复精细化工研究所）。

1.3 仪器

Tecan infinite M200 pro型酶标仪（瑞士帝肯公司）；ES-100A型电子天平（沈阳龙腾电子仪器公司）；AG 22331高速冷冻离心机（德国 Eppendorf公司）；Vortex-Genie 2型涡旋振荡器（美国SI公司）；Milli-Q型超纯水系统（美国密理博公司）；Bio-Gen PRO 200型精密匀浆机（美国PROScientific公司）；电热恒温水浴箱（北京长安科学仪器厂）；超低温冰箱（美国热电公司）；BC2600全自动血液细胞分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）。

2 方法

小鼠适应性喂养3 d，按体重随机分成5组：正常对照组、血虚模型组、组方低剂量组1.5g/kg、中剂量组3g/kg、高剂量组6g/kg，每组15只。给药组按给药剂量连续灌胃30d，每天1次；正常对照组和模型组灌胃给予相等体积的生理盐水。除正常对照组外，其余4组第26天开始给药1h后，分别经腹腔注射环磷酰胺100mg/kg，连续注射4d；正常对照组经腹腔注射等量的生理盐水。

2.1 外周血象测定

于末次给药后30min，眼眶取血，测定小鼠红细胞总数、白细胞总数和血红蛋白含量。

2.2 小鼠负重游泳实验

末次给药50 min后，鼠尾根部负荷7%体重的铅皮，置于游泳箱中游泳（水深25cm，水温28℃），记录小鼠自游泳开始至死亡的时间。以小鼠10 s内无法再浮出水面为依据，来判断动物死亡。

2.3 小鼠爬杆实验

末次给药50min后开始试验，将小鼠放到玻璃棒上，使肌肉处于静力紧张状态，记录小鼠由于肌肉疲劳从玻璃棒上跌落下来的时间，第3次跌落时终止实验，累计3次的时间作为爬杆时间。

2.4 血乳酸含量测定

末次给药30min后，在30℃水中不负重游泳10min后眼球采血20L，休息20min后采血20L，按试剂盒要求测定血乳酸含量。

2.5 血清尿素氮含量测定

末次给药50 min后开始实验。将小鼠置于水温为28℃游泳缸中不负重游泳60min，休息40min后，摘眼球取血，分离血清，按试剂盒说明书测定血尿素氮含量。

2.6 肝糖原含量测定

末次给药50 min后，处死小鼠，取肝脏0.05 g，经生理盐水漂洗后滤纸吸干，按试剂盒说明书测定肝糖原含量。

2.7 肌肉组织ATP酶活力测定

负重游泳实验结束后，取后肢肌肉组织，精密称量0.1g，生理盐水制成10%匀浆，按试剂盒说明书测定肌肉组织Na+K+ATP酶和Ca2+Mg2+ATP酶活力。

2.8 乳酸脱氢酶活力测定

末次给药50min后开始实验。将置于水温为28℃游泳缸中不负重游泳60min，休息40min的小鼠摘眼球取血，分离血清，按测试盒说明书测定血清乳酸脱氢酶活力。

3 结果

3.1 人参方对血虚小鼠血象的影响

由表1可见，与正常对照组相比，血虚模型组小鼠白细胞数目、红细胞数目和血红蛋白含量显著降低（P＜0.01），说明造血虚模型成功。与血虚模型组相比，人参方低、中、高3个剂量组红细胞和血红蛋白含量均明显升高（P＜0.05或P＜0.01），白细胞有升高趋势，但无明显统计学差异（P＞0.05）。血象的改变是血虚最明显的症状，人参方能明显改善血虚小鼠的外周血象。

表1 人参方对血虚小鼠血象的影响Table 1 The influence of ginseng prescription on hemogram of blood deficiency mice （,n=15）

注：与血虚模型组比较，*.P＜0.05，**.P＜0.01，***.P＜0.001。Note:Compareto blood deficiency model group,*.P＜ 0.05，**.P＜0.01，***.P＜ 0.001.

血红蛋白含量（g/L）HGB正常对照组 Normal control group 5.83±1.36 8.01±0.50 131.27±10.10血虚模型组 Blood deficiency model group 2.75±0.74 6.59±1.64 120.80±8.27人参方低剂量组 Ginseng prescription low dose group 2.53±0.71 7.63±0.90 124.20±16.28人参方中剂量组 Ginseng prescription medium dosegroup 2.86±0.84 8.25±0.70** 131.33±13.52*人参方高剂量组 Ginseng prescription high dosegroup 3.35±0.90 8.16±0.79** 134.20±14.91**组别Group白细胞数目（ 109/L）WBC红细胞数目（ 1012/L）RBC

3.2 人参方对血虚小鼠负重游泳时间的影响

与正常对照组相比，血虚模型组小鼠负重游泳时间显著缩短（P＜0.01）；与血虚模型组相比，人参方低剂量有延长小鼠负重游泳时间的趋势，但无明显统计学差异（P＞0.05）；人参方中、高剂量均能明显延长小鼠负重游泳时间（P＜0.01），见表2。小鼠负重游泳时间是衡量运动耐力时常选择的评价指标，负重游泳时间的长短可以反映小鼠运动疲劳的程度。因此，小鼠的负重游泳时间是小鼠肌肉运动能力的直观表现，其时间的长短代表了小鼠抵抗疲劳能力的大小。

表2 人参方对血虚小鼠负重游泳时间、爬杆时间和全血乳酸含量的影响Table 2 The influence of ginseng prescription on load swimming time,climbing pole timeand blood lactic acid content of blood deficiency mice （）

游泳后休息20 min Rest 20 min after swimming正常对照组Normal control group 515.20±137.28 579.47±186.03 5.70±1.61 5.78±1.57组别Group负重游泳时间（min）Load swimming time爬杆时间（min）Climbing poletime全血乳酸含量（mmol/L）Blood lactic acid content游泳10 min后After swimming 10 min血虚模型组Blood deficiency model group 332.20±105.66 251.60±73.14 7.35±2.20 7.75±2.34人参方低剂量组Ginseng prescription low dosegroup 358.60±100.80 312.20±99.10 5.37±1.32* 6.62±1.96人参方中剂量组Ginseng prescription medium dose group 511.47±160.91* 460.07±131.97*** 4.49±1.38*** 5.65±1.77**人参方高剂量组Ginseng prescription high dose group 521.87±161.72*** 511.20±158.01*** 4.10±1.18*** 4.41±1.14***

3.3 人参方对血虚小鼠爬杆时间的影响

与正常对照组相比，血虚模型组小鼠爬杆时间显著缩短（P＜0.01）；与血虚模型组相比，人参方低剂量有延长小鼠爬杆时间的趋势，但无明显统计学差异（P＞0.05）；人参方中、高剂量均能显著延长小鼠爬杆时间（P＜0.01），见表2。小鼠爬杆时间是衡量运动耐力时另一个经常选择的评价指标，累计爬杆时间的长短可以反应小鼠静用力时疲劳的程度。因此，累计爬杆时间是小鼠肌肉运动能力的直观表现，其时间的长短代表了小鼠抵抗疲劳能力的大小。

3.4 人参方对血虚小鼠全血乳酸含量的影响

小鼠游泳10 min后全血乳酸含量试验结果如表2所示，与正常对照组相比，血虚模型组小鼠全血乳酸含量显著升高（P＜0.05）；与血虚模型组相比，组方低、中、高剂量均能显著降低小鼠全血乳酸含量（P＜0.05或P＜0.001）。小鼠游泳后休息20 min测全血乳酸含量，试验结果与正常对照组相比，血虚模型组小鼠全血乳酸含量显著升高（P＜0.05）；与血虚模型组相比，人参方低剂量有降低小鼠全血乳酸含量的趋势，但无明显统计学差异（P＞0.05）；人参方中、高剂量能显著降低小鼠全血乳酸含量（P＜0.05或P＜0.01）。降低血乳酸水平是提高机体抗疲劳能力的途径。因此，减少血乳酸的产生，可延缓疲劳的发生。本试验测定结果游泳10 min后和休息20 min后的全血乳酸含量显著降低，表明人参方可提高小鼠的有氧代谢能力，使糖酵解过程中产生的乳酸不容易在肌肉组织蓄积，从而达到抵抗疲劳产生的效果。

3.5 人参方对血虚小鼠血清尿素氮含量的影响

与正常对照组相比，血虚模型组小鼠血清尿素氮含量显著升高（P＜0.01）；与血虚模型组相比，人参方低、中、高剂量均能降低小鼠血清尿素氮含量（P＜0.05或P＜0.01），见表3。机体血清尿素氮含量随运动负荷的增加而增加，随着血清尿素氮的增加，机体对负荷的适应能力差，显示疲劳的现象。因此，血清尿素氮与机体运动适应能力、疲劳程度以及负荷量的大小密切相关[8]，可作为评定疲劳程度的指标。

表3 人参方对血虚小鼠血清尿素氮含量、肝糖原含量、肌肉组织ATP酶活力和乳酸脱氢酶活力的影响Table 3 Theinfluence of ginseng prescription on serum urea nitrogen content,hepatic glycongen content,ATPenzyme activity in muscle tissue and activity of serum lactate dehydrogenase of blood deficiency mice （）

组别Group血清尿素氮含量（mmol/L）Serum urea nitrogen content肝糖原含量（mg/g）Hepatic glycongen content Ca2+Mg2+ATP酶活力（µmol/mg）Ca2+Mg2+ATP enzyme activity Na+K+ATP酶活力（µmol/mg）Na+K+ATP enzymeactivity血乳酸脱氢酶活力（U/L）Serum lactate dehydrogenaseactivity正常对照组Normal control group 10.18±3.14 5.95±1.47 4.32±0.88 3.96±0.53 4 912.22±450.12血虚模型组Blood deficiency model group 13.40±1.98 6.28±1.43 3.57±0.37 3.36±0.46 4 767.91±612.62人参方低剂量组Ginseng prescriptionlow dosegroup人参方中剂量组Ginseng prescription medium dosegroup人参方高剂量组Ginseng prescriptionhigh dose group 10.74±3.10** 5.61±1.04 3.59±1.18 3.31±0.79 4 802.68±888.39 10.53±2.90** 7.64±2.24 4.54±1.34* 4.14±0.99* 5 497.86±708.76**9.58±2.80*** 6.37±1.98 4.66±1.17** 4.55±1.23** 5 608.70±894.42**

3.6 人参方对血虚小鼠肝糖原含量的影响

与正常对照组相比，血虚模型组小鼠肝糖原含量无明显统计学差异（P＞0.05）；与血虚模型组相比，组方低、中、高剂量对小鼠肝糖原含量均无明显影响（P＞0.05），见表3。肝糖原的储备量可直接影响机体体能和运动性疲劳出现的快慢或程度，提高肝糖原的储备量或减少其消耗，有助于提高机体耐力和运动能力，有利于抵抗疲劳的产生[9]。

3.7 人参方对血虚小鼠肌肉组织ATP酶活力的影响

与正常对照组相比，血虚模型组小鼠Ca2+Mg2+ATP酶和Na+K+ATP酶活力显著降低（P＜0.01）；与血虚模型组相比，人参方低剂量组对小鼠 Ca2+Mg2+ATP酶和Na+K+ATP酶活力有增加趋势，无明显统计学差异（P＞0.05）；人参方中、高剂量组小鼠Ca2+Mg2+ATP酶和Na+K+ATP酶活力均显著升高（P＜0.05或P＜0.01），见表3。Ca2+Mg2+ATP酶活力有增加趋势，提示能够改善运动时骨骼肌的功能，有利于提高骨骼肌的收缩力和收缩速度，抵抗疲劳的产生[10]。增加Na+K+ATP酶的活力，提示人参方能够改善运动时骨骼肌的功能，有利于提高骨骼肌的收缩力和收缩速度，抵抗疲劳的产生。

3.8 人参方对血虚小鼠乳酸脱氢酶活力的影响

与正常对照组相比，血虚模型组小鼠血清乳酸脱氢酶活力有降低趋势，但无明显统计学差异（P＞0.05）；与血虚模型组相比，人参方低剂量组小鼠血清乳酸脱氢酶活力有升高趋势，但无明显统计学差异（P＞0.05）；人参方中、高剂量组小鼠血清乳酸脱氢酶活力显著升高（P＜0.01），见表3。乳酸脱氢酶活力大小直接影响着乳酸的清除速度，通过提高乳酸脱氢酶活力来降低血乳酸水平也是提高机体抗疲劳能力的途径[11]。

4 结论与讨论

抗疲劳验证试验检测的指标中，白细胞数目、红细胞数目、血红蛋白、小鼠负重游泳时间、爬杆时间、全血乳酸含量、血清尿素氮含量、Ca2+Mg2+ATP酶活力和Na+K+ATP酶活力含量9个指标实验结果均表明，血虚模型组与正常对照组相比，具有明显统计学差异（P＜0.05或P＜0.01），说明血虚模型小鼠耐疲劳能力明显下降，表明造模成功[12-14]。

与血虚模型组相比，人参方中、高剂量均能明显延长血虚小鼠负重游泳时间和爬杆时间，升高 Ca2+Mg2+ATP酶活力和Na+K+ATP酶活力，升高乳酸脱氢酶活力；人参方低、中、高剂量均能降低血虚小鼠血清尿素氮含量，降低全血乳酸含量，表明在中、高剂量或低、中、高剂量下，人参方可以提高血虚小鼠的运动耐力，降低静用力时疲劳，提高有氧代谢能力，改善运动时骨骼肌的功能[15-16]。但组方低、中、高剂量均对小鼠肝糖原含量无明显影响，可见并没有明显提高肝糖原的储备量或减少其消耗。

综上，按照中华人民共和国保健食品检验和评价技术规范中缓解体力疲劳功能评价判定规则，负重游泳时间和爬杆时间试验结果呈阳性、血清尿素氮和全血乳酸含量试验结果呈阳性，可判定该人参方对于血虚小鼠具有缓解体力疲劳功能的作用，可按照保健食品研究开发[17-20]。其机制可能是通过降低血清尿素氮水平，增强了机体对运动负荷的适应能力；提高血清乳酸脱氢酶活力，降低血乳酸的生成，从而延缓机体疲劳的产生；提高肌肉组织ATP酶活力，提高骨骼肌的收缩力和收缩速度，改善运动时骨骼肌的功能，抵抗疲劳的产生。