梅花鹿瘤胃液中芽孢杆菌的分离鉴定与系统发育树构建

刘晓颖，王卓，刘晗璐，鲍坤，李光玉※

（1.中国农业科学院特产研究所，长春 130112；2.吉林农业大学中药材学院，长春 130118）

梅花鹿是具有经济利用价值的动物之一，食性广，耐粗饲。梅花鹿瘤胃内寄居着大量的细菌、真菌、原虫、噬菌体和产甲烷菌等微生物，采食的精、粗饲料等物质在这些微生物的作用下，转化为梅花鹿生长所需的脂肪酸、氨基酸和维生素等营养物质[1]。目前，随着我国药物饲料添加剂将在2020年全部退出，益生菌制剂作为抗生素的替代品，可减少疾病的发生，且具有促生长、无公害、无残留、无污染等特点。然而，细菌具有宿主特异性，因此，用于益生菌的菌株以本动物源的菌株最佳。

由于芽孢杆菌在一定条件下生成芽孢，因此，具有耐受高温、耐酸碱、易于保存等特点，且在消化道中可以利用氧气，从而抑制有害细菌的生长，因此，经常被用做益生菌的候选菌株。本试验利用芽孢杆菌的耐高温特性，从梅花鹿瘤胃液中分离出7株芽孢杆菌，并通过细菌的生物学特征、16SrRNA序列分析和系统发育树构建相结合的方法，对这7株芽孢杆菌进行鉴定和分类，以丰富梅花鹿瘤胃微生物资源数据库，并为梅花鹿益生芽孢杆菌的研究开发提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料 瘤胃液采自中国农业科学院特产研究所鹿场装有永久瘤胃瘘管的梅花鹿[2]。

1.1.2 试剂 营养琼脂培养基、LB液体培养基等均按有关文献[3]配制；细菌微量生化鉴定管（广东环凯生物科技有限公司）；细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）；革兰氏快速染色液（珠海贝索生物技术有限公司）；厌氧袋和厌氧产气袋（日本3M公司）。

1.2 方法

1.2.1 芽孢杆菌的分离 将采集的梅花鹿瘤胃液用保温盒保存快速带回实验室，用无菌2层纱布过滤去掉残渣，取1mL加入到9mL无菌生理盐水中混匀，85℃水浴20 min；取0.5mL水浴后的瘤胃液，涂布于2个LB固体平板上，其中1个平板置于厌氧袋中，于37℃温箱中，待长出菌落后，挑取单个菌落进行涂片镜检。将G+杆菌菌落接种至LB液体培养基中培养，挑取单个菌落接种于营养肉汤培养基中，培养18～24 h后进行第2次划线分离。最后，将所得菌种进行第3次纯化并保存。

1.2.2 菌株生理生化鉴定 将上述分离的疑似芽孢杆菌接种到生理生化鉴定管中，37℃培养24h后观察结果，进行糖类发酵等生理生化指标的测定，同时，对单菌落进行触酶测定。

1.2.3 菌株16SrRNA序列的测定及系统发育树的构建 分离纯化的细菌进行总DNA提取（操作按说明书进行），凝胶电泳显示有DNA，提取细菌总DNA送至长春库美生物公司进行16SrRNA序列测定。所得序列利用EZTAXON软件在EzBio Cloud上进行同源性比较。选取同源性较高的典型菌株，将7株菌株与典型菌株序列利用MeGA6.0软件构建系统发育树[4]。

2 结果与分析

2.1 分离细菌的特点

根据分离出的细菌菌落特征、菌体形态，分离出7株芽孢菌，DYJ-7呈菜花样菌落，DY-12和DYX-7呈灰白色干酪样菌落，而 DY-1、DY-10、DY-4、DY-14呈薄层白色菌落。经革兰氏染色镜检观察，菌体均为革兰氏阳性杆菌，长短不一，两端呈圆形，单个或成对存在，有的菌体有芽孢。

2.2 分离菌株的生理生化鉴定

触酶试验结果表明，分离的7株细菌触酶试验结果均呈阳性；7株菌糖发酵试验中木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、山梨醇、棉子糖均呈阴性；7株分离菌的靛基质反应、苯丙氨酸、MR试验结果也均呈阴性；DY-10在所有的糖发酵管中都不反应，其余6株均能利用葡萄糖；DY-12、DYJ-7硝酸盐还原试验结果呈阴性，其余5株分离菌呈阳性。分离菌株的具体生理生化鉴定结果见表1。

2.3 菌株特异性16SrRNA的序列分析与系统发育树的构建[5-6]

对7株分离的细菌进行16S rRNA序列测定发现，7株菌16SrRNA序列长度为1 400 bp左右，与EzBioCloud上EZTAXON序列进行比对，DYJ-7与地衣芽孢杆菌的序列相似性达99.76%；DY-12、DYX-7与枯草芽孢杆菌的序列相似性达100%；DY-4与木聚赖氨酸杆菌的序列相似性达99.37%；DY-10与大型赖氨酸杆菌的序列相似性达99.58%；DY-1、DY-14与纺缍形赖氨酸芽孢杆菌的序列同源性达99.58%。结合分离菌株革兰氏染色阳性、菌落形态特征、生理生化特征，最后确定分离的7株细菌中3株隶属芽孢杆菌科芽孢杆菌属，4株隶属芽孢杆菌科赖氨酸芽孢杆菌属。将7株菌株的16SrRNA序列与GenBank上3株同源性较高的菌株序列Bacillussubtilisstrain DOSSTR-3 (MF076235.1)、B.licheniformis strain P15（MG753545.1）、Lysinibacillusfusiformisstrain BCH540（KM983010.1），利用MeGA6.0软件构建系统发育树，如图1所示。从图1可以看出，菌株DY-12、DYX-7与DYJ-7 亲缘关系较近，而DY-4、DY-14 与DY-1、DY-10亲缘关系较近。

表1 7株梅花鹿瘤胃分离细菌的生理生化鉴定结果Table 1 The physiological and biochemical identification results of 7 strains of isolated bacteria from the rumen of sika deer

图1 7株分离菌的系统发育树分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of 7 isolates of bacteria

3 结论

本试验利用85℃水浴20 min LB平板培养基，根据分离菌株的菌落特征、具体形态，从梅花鹿瘤胃液中分离出7株芽孢菌，DYJ-7呈菜花样菌落，DY-12、DYX-7呈灰白色干酪样菌落，DY-1、DY-10、DY-4、DY-14呈黄色、半透明、湿润菌落。经革兰氏染色镜检观察，菌体均为革兰氏阳性杆菌，长短不一，两端呈圆形，单个或成对存在，有的菌体有芽孢，随着培养时间和培养基酸碱度的改变，菌体大小也有差异。

对分离的7株细菌进行部分生理生化鉴定，触酶试验结果均呈阳性，不能利用木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、山梨醇、棉子糖，靛基质反应、苯丙氨酸、MR试验结果呈阴性；DY-10在所有的糖发酵试验均都不反应，其余6株均能利用葡萄糖；DY-12、DY-7硝酸盐还原试验结果呈阴性，其余5株呈阳性。

虽然7株分离菌在营养琼脂培养基上生长的菌落形态、颜色、革兰氏染色镜下形状不同，但由于细菌的多样性，只是通过菌落形态、染色特性和生理生化鉴定并不能确定，为此本试验提取了7株纯化细菌的基因组DNA，进行了16S rRNA的测序，并进行了同源性分析。将7株菌株的16SrRNA序列与3株同源性较高的菌株GenBank上的序列，利用MeGA6.0软件构建系统发育树。结合菌落形态和生理生化指标，确定分离的7株细菌中3株菌为芽孢杆菌科芽孢杆菌属，4株菌为芽孢杆菌科赖氨酸芽孢杆菌属。