液相色谱-质谱联用技术检测婴幼儿乳粉中的丙烯酰胺

于晓瑾，王浩，张杉，张旭，陈江龙

（北京市食品安全监控和风险评估中心（北京市食品检验所），国家食品质量安全监督检验中心，北京100094）

0 引 言

婴幼儿配方乳粉是可以替代母乳为婴儿提供合理营养素的配方食品，产品的质量和安全直接关系到以此为全部或大部分营养来源的婴幼儿的健康和生长发育。前些年，我国层出的婴幼儿食品安全事件反映出我国婴幼儿配方食品行业和安全监管方面存在许多薄弱环节。为了解决婴幼儿乳粉的安全问题，我国从2008年“三聚氰胺”事件以来，我国对婴幼儿配方食品的标准进行整顿，并出台了一系列迄今为止最严格的法规制度，对婴幼儿配方乳粉的配方、生产、销售的全过程进行严格监管，以期重塑消费者对国产奶粉的信心。从近几年的监督抽检结果可知，我国婴幼儿配方乳粉的质量得到了极大的提高。但为了促进我国婴儿配方食品的良性发展，仍然需要对婴幼儿配方食品中一些可能存在的污染物进行研究。

在特定条件下，羰基化合物（还原糖）和氨基化合物（蛋白质、氨基酸）发生非褐变的美拉德反应，使得反应后的食物色香味俱全，但在此条件下容易人为产生有害物质—丙烯酰胺（Acrylamide，AA）[1]。一般认为，丙烯酰胺主要存在于高温（100℃以上）煎炸、烘烤的食品中，如油炸土豆片、薯条、面包、饼干和谷物早餐等[2]。

婴幼儿配方乳粉中含有与美拉德反应相关的并易于形成丙烯酰胺的化学物质，如含羰基的化合物（乳糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖等）和含氨基的化合物（氨基酸），并且在加工过程中也会经历喷雾干燥等加热过程，所以也会有产生丙烯酰胺的可能性。最近，德国科学家有报道称在一些婴儿食品中发现较高的丙烯酰胺,有的含量甚至相当于炸薯条的2倍[3]。研究表明，对人和动物而言，丙烯酰胺主要是一种神经毒素。其次，它还具有一定的致癌性、致突变性和生殖毒性[4-6]，国际癌症研究所（IARC）将其列为2类致癌物（2A）即人类可能致癌物。

目前检测食品中丙烯酰胺的国标检测方法（GB 5009.204-2014）只针对热加工食品，不适用于婴幼儿乳粉中丙烯酰胺的检测。根据婴幼儿乳粉中有毒有害物质的安全监管要求，丙烯酰胺也已被列入监管项目，因此，及时寻求简便、快速、准确、敏感性高的婴幼儿乳粉中的丙烯酰胺检测方法才能满足日趋严格的残留限量要求，从而保障广大婴幼儿的身体健康。

根据文献检索资料获知，国内外测定丙烯酰胺的常用方法主要有气相色谱-质谱联用法[7-8]、高效液相色谱法[9]和液相色谱-串联质谱联用法[10-13]，其他还有生物传感器快速检测[14]、微分脉冲伏安法[15]、直接竞争酶联免疫法[16]等一些非常规检测方法。气相色谱-质谱联用法需要进行衍生，导致前处理时间较长，溶剂消耗大；高效液相色谱法的检测灵敏性较低，检测结果存在假阳性。针对上述存在的问题，本文中先将样品经水溶解，用乙腈去除蛋白，正己烷除脂，采用高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪进行检测，同位素内标定量，该方法前处理简单，灵敏度高，适用于婴幼儿乳粉中丙烯酰胺的检测。

1 实 验

1.1 材料、试剂与仪器

婴幼儿配方乳粉，市购或检验样品。

甲醇、乙腈、正己烷（色谱纯），德国Fisher公司；丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺同位素内标（w≥99%），美国Sigma公司。

串联三重四极杆质谱（6410型）、液相色谱仪（1200型），美国Agilent公司；超声波清洗仪（KQ-5200型），昆山市超声仪器有限公司；去离子水发生器，美国milli-Q公司。

1.2 标准溶液

丙烯酰胺标准储备液：准确称取10.0 m g的标准品于10 m L容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制成1 m g/m L的标准储备液，-18℃以下保存。

13C3-丙烯酰胺同位素内标储备液：准确称取10.0 m g的同位素内标于10 m L容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制成1 m g/m L的标准储备液，-18℃以下保存。

用甲醇将丙烯酰胺标准储备液和13C3-丙烯酰胺同位素内标储备液分别配制成浓度为0.5μg/m L的中间浓度标准溶液和中间浓度同位素内标溶液，4℃以下保存。

基质标准校准溶液：称取阴性样品，先加入20μL的中间浓度同位素内标溶液，再加入适量的中间浓度标准溶液，使丙烯酰胺最终添加浓度分别为5 ng/m L、10 ng/m L、20 ng/m L、50 ng/m L、100 ng/m L。

1.3 样品处理

准确称取1.0 g样品（精确至0.01 g），置于10 m L具塞比色管中，加入2 m L水，涡旋30 s充分溶解后，再依次加入中间浓度内标溶液20μL，乙腈3 m L，具塞振摇1 min，超声提取10 min，静置，待蛋白质沉淀后，吸取1 m L上清液用4 m L乙腈饱和的正己烷液液分配，除去脂肪，过0.20μm有机滤膜后，待用液相色谱-串联质谱测定。

1.4 分析条件

1.4.1 液相色谱条件

色谱柱：H ypersil GOLD C18柱，1.9μm，50 mm×4.6 mm（i.d.）；流速0.20 m L/min；柱温：25℃；进样量5μL。

流动相：流动相：水（A）+甲醇（B）；梯度洗脱：0～5 min，B保持4%；5～5.1 min，B由4%线性递增至100%；5.1～10 min，B保持100%；10～10.1 min，B由100%线性递减至4%；10.1～15 min，A保持4%。

1.4.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应检测；干燥气：N2；雾化气压力：275.8 kPa；干燥气温度：300℃；干燥气流速：8 L/min。丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺内标质谱分析的条件参数如下表1所示。

表1 标准品的质谱参数

2 结果与讨论

2.1 样品提取溶液选择

丙烯酰胺既易溶于水，又溶于乙腈。同时，婴幼儿乳粉基质复杂，富含脂肪和蛋白质，所以本方法在样品中先加入2 m L水，涡旋1 min，使样品中丙烯酰胺充分溶解，再加入3 m L乙腈，去除样品中蛋白质，再用乙腈饱和的正己烷除脂。这种前处理的方法简便快速，定量限低于国标方法（10μg/kg），加标回收率高（平均加标回收率＞85%），可以完全满足实际检测要求。

2.2 基质效应的影响

化学分析中，基质指的是样品中被分析物以外的组分。基质常常对分析物的分析过程有显著的干扰，并影响分析结果的准确性。乳粉富含油脂蛋白质，为了消除测定液中存在的基质效应，本方法首先在前处理过程中采取除油除蛋白处理，同时采用空白样品同位素内标法定量，极大程度消除测定中的基质效应，同时又明显提高了定量的准确性。

2.3 质谱条件的优化

采用直接进样方式分别将浓度为200 ng/m L的丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺内标用蠕动泵注入离子源中，在正离子检测方式下进行母离子全扫描，得到丙烯酰的分子离子峰为72.1。以该离子峰为母离子，进行二级质谱扫描，最后采集全扫描的二级质谱图，得到碎片离子信息，再对得到的二级质谱参数如破碎电压、碰撞能量等进行优化，使定性离子与定量离子产生的离子对强度比例达到最大时为最佳，得到丙烯酰胺的最佳质谱参数。由于丙烯酰胺分子量较小，汽化温度较高时，分子结构已断裂，造成离子化效率不高，因此，本方法选择干燥气温度为300℃。同时，在碰撞电压为10 eV时，m/z 44.1和m/z 55.1碎片离子的强度比较大，因此选择这两个离子作为定量及定性检测离子。相同条件下，得到13C3-丙烯酰胺内标分子离子峰为75.0，定量离子为58.0。

图1 碰撞能量为10 eV时丙烯酰胺的质谱图

2.4 色谱条件的优化

2.4.1 色谱柱的选择

为了有利于色谱峰的分离及锋形的改善，本方法分别采用资生堂MGⅢ-C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，1.8μm）、H ypersil GO LD C18色谱柱（50 mm×4.6 mm，1.9μm）和Agilent Extend-C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，5μm）进行分离试验，发现H ypersil GOLD C18色谱柱（50 mm×4.6 mm，1.9μm）峰形及出峰时间较为合适。

2.4.2 色谱分离条件选择

丙烯酰胺为强极性化合物，色谱柱上保留较弱，为了有利于色谱峰的分离及检测的要求，本方法采用水-甲醇为流动相，利用梯度洗脱的方法提高分离及检测效果效果，测试开始时，流动相中水-甲醇的比例为96∶4，然后在0～5 min保持此将比例，这一部分主要是使测定液中目标化合物和极性较强的杂质相分离，5～5.1 min内将改变二者的比例为0∶100，5.1～9 min保持此比例，这一部分主要是洗脱测定液中色谱柱上保留较强的杂质。通过上述两步梯度，在9 min内，可以较好的分离测定液中的丙烯酰胺，从图2中可以看出丙烯酰胺得到较好的分离。

图2 丙烯酰胺加标样品的MRM色谱图

2.5 标准曲线和方法检出限

按浓度由小到大的顺序，将基质标准溶液分别注入高效液相色谱/串联质谱仪中，按上述仪器条件进行测定，得到丙烯酰胺及其内标峰面积。以基质标准溶液的浓度为横坐标，以目标化合物峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线，并计算线性方程和相关系数。得到的标准曲线线性范围为10.0～200.0μg/L，回归方程为y=1.0365x-0.0152（y为峰面积，Counts；x为浓度，ng/m L）；线性相关系数R2=0.9997。同时用空白样品进行加标实验，根据信噪比均大于3的条件设定检出限，得到方法的检出限为5μg/kg，根据信噪比大于10的条件设定定量限，得到方法的定量限为10μg/kg。

2.6 回收率和精密度

分别准确称取已知空白样品6份，每份1.00 g，共3组，分别加入添加水平为10μg/kg、20μg/kg、100 μg/kg的丙烯酰胺标准品，再均添加50μg/kg内标标准品，按样品处理条件进行前处理后上机测定，结果见表2。从表2中可看出，不同浓度平均加标回收率为92.2%～104.8%，平均相对标准偏差为2.37%～9.61%（n=6），满足试验要求。

表2 丙烯酰胺的加标回收率

2.7 实际样品分析

利用本方法对市场销售的50种婴幼儿营养乳粉进行检测，其中9个样品检出检出丙烯酰胺，检出浓度范围为5.60μg/kg～11.7μg/kg，检出率为18%。上述结果表明，丙烯酰胺确实存在于婴幼儿营养乳粉中，其对婴幼儿健康存在的风险应当引起国家监管部门及生产企业重视。

图3 丙烯酰胺阳性样品（丙烯酰胺浓度11.7μg/kg）的MRM色谱图

3 结 论

本文建立了婴幼儿乳粉中丙烯酰胺残留的液相色谱-串联质谱测定方法。该方法样品加标回收率方法回收率为92.2%～104.8%，相对标准偏差（RSD）为2.37%～9.61%（n=6）。该方法前处理简单，适合于大量样品的快速筛查，方法的灵敏度和准确度均满足国家标准方法的检测要求，适用于婴幼儿乳粉中丙烯酰胺残留的监控检测。根据市售婴幼儿乳粉样品的分析，丙烯酰胺残留的检出率达到18%，

检验样品中最高残留量大于10μg/kg，世界卫生组织2000年公布的人均每日丙烯酰胺摄入量为每公斤体重0.3～0.8μg，婴幼儿作为以乳粉为主要食物的人群，乳粉的摄入量较高，故具有较高的安全风险，建议对婴幼儿乳粉中的丙烯酰胺残留进行严格的风险监控。