基于药效学和化学方法的金蕾复方醇提工艺优选

2019-07-01张旭东柳娜芦彦兆赵慧巧寇亮陈晖景明

中国中医药信息杂志 2019年5期

张旭东柳娜芦彦兆赵慧巧寇亮陈晖景明

摘要：目的优选金蕾复方醇提工艺条件。方法以金蕾复方药液对胆汁淤积小鼠模型的干预效果为指标筛选最佳提取溶媒，以当药黄素、当药醇苷含量及干膏率为综合考察指标，采用L9（34）正交试验对料液比、提取时间、提取次数进行优化，筛选最佳提取工艺参数。结果金蕾复方醇提最佳工艺条件为：以70%乙醇为提取溶剂，料液比为1∶8，提取时间为1 h，提取次数为2次。结论本试验优选的提取工艺保证了金蕾复方的药效，简单合理、稳定可行，可用于该制剂的工业化生产。

关键词：金蕾复方;正交设计;药效学;提取工艺

中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2019）05-0073-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.05.016 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Objective To optimize the conditions for the ethanol extraction of Jinlei Compound. Methods The optimal extraction solvent was selected by the intervention effect of Jinlei Compound liquid on the cholestasis model of mice. With composite score of the contents of swertisin and swertianolin and dry extract yiled as indexes， effects of the amount of water， extraction time and times on extraction process were investigated by L9（34） orthogonal test， then the optimum extraction process parameters were obtained. Results The optimum conditions for the ethanol extraction of Jinlei Compound was as follows： 70% ethanol as the extraction solvent， extracting 2 times with 8 times the amount of water， 1 hour each time. Conclusion The optimized extraction process not only ensures the efficacy of Jinlei Compound， but also is simple， reasonable， stable and feasible， which is suitable for industrial production of the preparation.

Keywords： Jinlei Compound; orthogonal design; pharmacodynamics; extraction process

胆囊炎是发生于胆囊部位的急慢性炎症，随着人们饮食结构和习惯的改变，其发病率逐年升高。金蕾复方是甘肃省名中医张银川主任中医师的临床经验方，由湿生扁蕾和金钱草两味药组成。湿生扁蕾为藏药，性寒味苦，清热解毒、消炎利胆，藏医常用于治疗胆囊炎、肠胃炎等消化系统疾病[1];金钱草性寒味甘，清利湿热、利尿排石，有“石淋要药”之称[2]。两味药君臣搭配，对胆囊炎具有较好的疗效。本研究通过药效学方法对金蕾复方提取溶媒进行筛选，并进一步采用正交试验优选最佳提取工艺，以期寻求一种既能保证药效又方便可行的工艺，为该复方制剂的工业化生产提供切实的依据。

1 仪器、试药与动物

Agilent 1260高相液相色谱仪（DAD检测器），美国安捷伦公司;XPE105型分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司;MH-2000型电热套，北京科伟永兴仪器有限公司;Lab Tech EV型旋转蒸发器，美国莱博泰科公司;SB5200D型超声波清洗仪，宁波新芝生物科技股份有限公司;HGZF-9203型电热恒温鼓风干燥箱，上海跃进医疗器械有限公司;DZF-6020型真空干燥箱，上海博远实业有限公司;GFL3033型氣浴恒温摇床，德国GFL;BX51-32H01系统显微镜，日本Olympus;10705型Benchmark Plus连续波长酶标仪，美国BIO-RAD。

湿生扁蕾采自甘肃省渭源县乱柴沟地域，由甘肃农业大学陈垣教授鉴定为龙胆科扁蕾属植物湿生扁蕾Gentianopsis Paludosa（Munro）Ma.的干燥全草;金钱草购自甘肃省兰州市黄河中药材市场，由甘肃农业大学陈垣教授鉴定为报春花科珍珠菜属植物过路黄Lysimachia christinae Hance.的干燥全草。两味药材均粉碎，过80目筛，备用。1-萘异硫氰酸酯（ANIT），批号N814658，麦克林生化科技有限公司;花生油，批号XA20170601，山东鲁花集团有限公司;总胆红素（TBil）试剂盒、直接胆红素（DBil）试剂盒、总胆汁酸（TBA）试剂盒，南京建成生物科技有限公司;当药黄素对照品（批号140525）、当药醇苷对照品（批号140521），HPLC纯度均大于98%，成都普菲德生物科技有限公司;甲醇（色谱纯）、乙醇（分析纯），批号均为20170801，天津市大茂化学试剂厂;磷酸（分析纯），天津欧博凯化工有限公司，批号20100618。

SPF级昆明种小鼠60只，体质量18～22 g，鼠龄30 d，甘肃中医药大学动物实验中心，生产许可证号SCXK（甘）2015-0002，使用许可证号SYXK（甘）2015-0005。饲养于甘肃中医药大学中药药理实验室，环境温度（22±2）℃，相对湿度50%～60%。根据实验分组分笼喂养，自由摄食饮水。

2 方法与结果

2.1 提取溶媒单因素考察

2.1.1 不同溶媒提取物的制备

金蕾复方提取液由湿生扁蕾和金钱草按一定比例配伍，分别用水及不同体积分数乙醇溶液（60%、70%、80%）作溶媒提取。料液比为1∶8，提取时间为2 h，提取次数为2次，提取结束后合并2次滤液，沉淀过夜，次日取上清液，在旋转蒸发仪上回收乙醇，浓缩药液。分别制得金蕾复方水提液（水提液）、金蕾复方60%乙醇提取液（60%醇提液）、金蕾复方70%乙醇提取液（70%醇提液）、金蕾复方80%乙醇提取液（80%醇提液），均相当于原药材1.5 g/mL，备用。

2.1.2 造模及给药

取昆明种小鼠60只，随机分为正常组、模型组、水提组、60%醇提组、70%醇提组、80%醇提组，每组10只，适应性喂养3 d。金蕾复方的成人（70 kg）每日用量为原药材60 g，按比表面积等效剂量换算，小鼠给药剂量为成人的9.0倍[3]，即每1 kg体质量小鼠给予含原药材7.8 g的药液灌胃。各给药组按小鼠体质量分别给予相应金蕾复方提取液5.2 mL/kg灌胃，正常组和模型组给予等体积生理盐水灌胃，连续14 d。参照罗琳等[4]的造模方法，除正常组外，其余各组给予10 mL/kg的ANIT溶液（溶剂为花生油，浓度11.21 mg/mL）灌胃造成小鼠胆汁淤积模型，正常组给予相应剂量花生油灌胃。造模结束后禁食不禁水12 h，各组小鼠股动脉取血，离心，取上层血清，ELISA检测血清TBil、DBil、TBA含量;摘取胆囊，测量胆汁量（完整胆囊质量-吸除胆汁后的胆囊质量）[5];摘取肝脏，取汇管区部位，4%甲醛固定，HE染色切片，光学显微镜下观察肝组织病理变化。

2.1.3 统计学方法

采用SPSS20.0统计软件进行分析。计量资料用 ±s表示，组间比较采用两独立样本t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2.1.4 提取溶媒单因素考察结果

生化检测结果显示，模型组小鼠TBil、DBil、TBA含量及胆汁量明显高于正常组（P<0.05），表明该胆汁淤积模型成功。与模型组比较，各给药组小鼠TBil、DBil和TBA含量均有降低趋势，表明金蕾复方提取物在一定程度上具有缓解胆汁淤积的作用，其中70%醇提组各指标降低趋势更明显，与水提组比较差异有统计学意义（P<0.05），见表1。肝组织HE染色结果显示：对照组小鼠肝细胞排列整齐，几无变性坏死，无炎性细胞渗出，无胆管增生;模型组肝细胞可见大片点、灶状变性坏死，肝索排列紊乱，部分毛细胆管内胆汁淤积，汇管区胆管增生，有大量炎性细胞浸润;水提组小鼠仍见有肝细胞坏死，以胆管周围尤为明显，肝小叶结构破坏，汇管区有炎性细胞浸润;3个醇提组与模型组比较，肝细胞损伤有明显好转，其中70醇提组肝细胞结构基本恢复，偶见炎性细胞渗出，点、灶状坏死不明显。见图1。

2.2 正交试验优选醇提工艺

根据单因素溶媒考察结果，确定提取溶媒为70%乙醇溶液，设计如下正交试验：取处方量的湿生扁蕾和金钱草细粉共50 g，以料液比、提取时间和提取次数3个因素作为考察对象，每因素选取3个水平（见表2），以提取物的干膏率（权重为60%）[6]、当药黄素含量（权重为20%）和当药醇苷含量（权重为20%）为指标，选用L9（34）正交试验表进行试验，计算综合评分，筛选最佳提取工艺。综合评分=干膏率÷最大干膏率×100×60%+当药黄素含量÷当药黄素最大含量×100×20%+当药醇苷含量÷当药醇苷最大含量×100×20%。

2.2.1 干膏率测定

取待测定的已知浓度为C g/mL的提取液V mL，置于已干燥至恒重的蒸发皿中称定质量（M1），水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，移至干燥器，冷却至室温，迅速精密称定质量（M2），平行测定3次，计算干膏率。干膏率（%）=（M1-M2）÷（C×V）×100%。

2.2.2 当药黄素和当药醇苷含量测定

2.2.2.1 色谱条件及方法学考察

采用Agilent SB-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 ?m）;流动相为0.10%磷酸水溶液（A）和甲醇（B），0～10 min为A∶B=70∶30～60∶40线性梯度洗脱，10～17 min为A∶B=60∶40～50∶50线性梯度洗脱，17～40 min为A∶B=50∶50～30∶70线性梯度洗脱，40～50 min为A∶B=30∶70等度洗脱;流速1.0 mL/min;检测波长270 nm;柱温30 ℃;进样量5 ?L。

该色谱条件下，当药黄素在11.3 min处出峰，当药醇苷在16.3 min处出峰。当药黄素回归方程为Y=3.283 9X-0.605 5，r2=0.999 9，当药黄素在48.6～340.5 ?g/mL范围内线性关系良好，精密度RSD=0.17%（n=5）;当药醇苷回归方程为Y=4.190 6X+5.778 4，r2=0.999 9，当药醇苷在48.4～338.2 ?g/mL范围内线性关系良好，精密度RSD=0.21%（n=5）。在该色谱条件下，当药黄素和当药醇苷均具有良好的分离度，见图2。

2.2.2.2 对照品溶液的制备

称取当药黄素和当药醇苷对照品各15 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得当药黄素和当药醇苷的混合对照品溶液，其中当药黄素浓度为0.608 mg/mL，當药醇苷浓度为0.604 mg/mL。精密吸取混合对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，置2.5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，配成当药黄素和当药醇苷的系列混合对照品溶液。

2.2.2.3 供试品溶液的制备

按含原药材5 g的比例，称取9次正交试验所得干膏粉，并精密称定，分别置于25 mL容量瓶中，加甲醇，超声（功率250 W，频率50 kHz）10 min溶解，并定容至刻度。

2.2.2.4 样品含量测定

取“2.2.2.3”项下供试品溶液，进样量为5 ?L，按标准曲线计算当药黄素和当药醇苷的含量，并计算每克干膏粉中当药黄素和当药醇苷的量。

2.2.3 正交试验结果与分析

正交试验结果见表3，方差分析见表4。通过直观分析可以看出，各因素对金蕾复方醇提工艺的影响为C>A>B，根据方差分析可知，C因素（提取次数）和A因素（料液比）对综合评分有显著影响，根据LSD两两比较方差分析并结合生产实际需要，确定最优水平组合为A1B1C2，即料液比为1∶8，提取时间为1 h，提取次数为2次。

2.2.4 验证试验

称取处方量湿生扁蕾和金钱草细粉50 g，按优选出的提取工艺进行3批验证试验。结果表明，该工艺稳定可行，符合大生产要求，见表5。

3 讨论

中医自古就有方与法之说，方为药方，法为药方的炮制、煎煮、調配、服用等方法[7]。徐灵胎有言：“煎药之法，最宜深讲，药之效与不效，全在乎此。”古方记载青蒿捣碎取汁液可治疗疟疾，现代研究发现，青蒿（实为黄花蒿）只有用乙醚低温提取才能得到具有较强抗疟活性的青蒿素[8]。可见，提取方法不同，中药的疗效亦有差别，提取是确保中药制剂质量的关键性因素。目前，大生产中仍采用传统提取方法，其原理为相似相溶性原理，故而提取所用溶媒在提取有效成分过程中具有很重要的作用。本研究先通过药效学手段筛选出最佳提取溶媒，以确保后续提取工艺所得为具有药理学活性的提取物。

药理研究表明，金钱草和湿生扁蕾均具有镇痛、抗炎、利胆等功效，且两味药都含有黄酮类、多糖类及苷类成分[9-11]。在不确定其主要药效成分的前提下，为确保该处方疗效，应尽可能多提取其中的不同种类成分。本研究选择采用不同浓度乙醇作为提取溶媒，原因有二：一是乙醇作溶媒无毒害，且醇提有助于药物成分入血[7];二是黄酮类成分和多糖类成分都可以通过乙醇溶液提取出来。因此，本试验筛选出70%乙醇提取物药效结果最佳具有一定的科学依据。此外，在制剂的大生产中，提取物的出膏率是一个很重要的考察指标。出膏率的多少影响制型的成形、辅料种类和用量的选择，以及服用剂量等，因此将出膏率纳入考察指标具有一定的实际意义[12]。由于金蕾复方中当药黄素和当药醇苷是否为主要药效成分尚不确定，不能通过有效成分含量来控制制剂的质量，故采用传统的以干膏率为主的质量控制方法。此外，考虑到大生产的成本问题，出膏率高时，单位成本降低。因此，综合评分选择以出膏率权重占60%作为考察指标符合生产及质量要求[6]。

综上，本研究通过药效学结合化学方法有针对性地筛选出能够确保药效的提取工艺，具有一定的创新性和实用性。但仍然存在一些不足，如未考虑其他提取溶媒;正交试验无法对未考察的参数进行预测，筛选出的工艺参数不一定是极值;HPLC含量检测为君药中的成分，考察指标可能不够全面等。提示本研究还需进行更全面、细化的工艺筛选，以取得最佳提取工艺，应用于生产中。

参考文献：

[1] 卢年华，赵慧巧，刘娟娟，等.藏药湿生扁蕾及扁蕾的相关本草考证[J].西部中医药，2017，30（6）：46-49.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：19-220.

[3] 黄继汉，黄晓晖，陈志扬，等.药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算[J].中国临床药理学与治疗学，2004，9（9）：1069-1072.

[4] 罗琳，梁烨莹，王蓬波，等.α-萘异硫氰酸酯致小鼠胆汁淤积肝损伤作用的研究[J].毒理学杂志，2012，26（5）：340-343.

[5] 杨错，邢立国，刘玉兰.柴胡对小鼠肝再生及胆汁分泌作用的研究[J].中华中医药学刊，2005，23（11）：2066-2067.

[6] 张为亮.浅谈中药提取的出膏率控制[J].中国中药杂志，2008，33（7）：849-850.

[7] 张立双，江丰，赵晨，等.中药汤剂煎煮法的文献调查分析[J].天津中医药，2017，34（6）：422-428.

[8] 袁亚男，姜廷良，周兴，等.青蒿素的发现和发展[J].科学通报，2017， 62（18）：1914-1927.

[9] 俞仑青.金钱草的药理作用及临床应用概况[J].中国现代药物应用， 2011，5（14）：131-132.

[10] 李军，蔡泓，王君明，等.金钱草化学成分、药理作用及临床应用[J].中国老年学杂志，2017，37（24）：6262-6264.

[11] 李硕，景明.藏药湿生扁蕾化学成分及药理作用研究进展[J].甘肃中医药大学学报，2015，32（1）：69-73.