青光安有效组分对兔青光眼术后滤过道瘢痕组织中胶原纤维、成纤维细胞特异性蛋白-1、结缔组织生长因子及转化生长因子-β1表达的影响

蒋鹏飞 黄学思 彭俊 李苑碧 喻娟 彭清华

摘要：目的  觀察青光安4种有效组分对兔青光眼术后滤过道瘢痕组织中胶原纤维、成纤维细胞特异性蛋白-1（FSP-1）、结缔组织生长因子（CTGF）、转化生长因子-β1（TGF-β1）表达的影响，对比青光安4种有效组分及青光安混悬液抗滤过道瘢痕化的效果。方法  采用青光眼滤过手术制作动物模型。实验兔按体质量随机分为空白组（A组）、模型组（手术对照组，B组）、丝裂霉素C组（C组）、有效组分1组（D组）、有效组分2组（E组）、有效组分3组（F组）、有效组分4组（G组）和青光安混悬液组（H组）。各给药组给予相应药物。观察各组兔滤过道瘢痕组织中胶原纤维、FSP-1、CTGF、TGF-β1水平。结果  术后C、E、H组兔眼压回升缓慢，眼压值较术前和A组差异均有统计学意义（P<0.05）;胶原纤维面积比值除B、D、G组外，其他各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）;FSP-1表达除B、G组外，其他各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）;CTGF表达除B、D、G组外，其他各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）;TGF-β1表达除B、G组外，其他各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。结论  青光安有效组分2、丝裂霉素C及青光安混悬液通过抑制胶原纤维、FSP-1、CTGF、TGF-β1的表达，降低肌成纤维细胞和成纤维细胞的增殖，从而减少滤过道瘢痕组织的增生，有明显抗青光眼术后滤过道瘢痕化的作用，青光安有效组分2和青光安混悬液抑制滤过道瘢痕化效果基本相当。

关键词：青光安有效组分;青光眼;滤过道瘢痕化;胶原纤维;成纤维细胞特异性蛋白-1;结缔组织生长因子;转化生长因子-β1;兔

中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）05-0059-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.05.013 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Objective To observe the effects of effective components of Qingguang'an on collagen fibers， fibroblast-specific protein-1 （FSP-1）， connective tissue growth factor （CTGF） and transforming growth factor-β1 （TGF-β1） in rabbits after glaucoma surgery; To compare the four effective components of Qingguang'an and the effects of Qingguang'an suspension on scarring of filtration passage. Methods Glaucoma filtering surgery was used to make animal models. The rabbits were randomly divided into blank group （group A）， model group （surgical control group， group B） and mitomycin C group （group C）， effective component 1 group （group D）， effective component 2 group （group E）， effective component 3 group （group F）， effective component 4 group （group G） and Qingguang'an suspension group （group H） according to body weight. Each administration group was given relevant medicine. The levels of collagen fibers， FSP-1， CTGF and TGF-β1 in the scar tissue of rabbit filtration passage in each group were observed. Results After surgery， the intraocular pressures of group C， E and H were slow， with statistical significance  compared with preoperation and group A， （P<0.05）. The area ratio of collagen fibers was statistically significant  except for the comparison among group B， D and G （P<0.05）. The expression of FSP-1 was statistically significant among the other groups except for the comparison between group B and group G （P<0.05）. The expression of CTGF was statistically significant among the other groups except for the comparison among group B， D and G （P<0.05）. The expression of TGF-β1 was statistically significant among the other groups except for the comparison between group B and G group （P<0.05）. Conclusion Effective component 2 in Qingguang'an， mitomycin C and Qingguang'an suspension can reduce the proliferation of myofibroblasts and fibroblasts by inhibiting the expressions of collagen fibers， FSP-1， CTGF and TGF-β1， and show obvious anti-glaucoma scarring effect after filtration. The efficacy of effective component 2 in Qingguang'an and Qingguang'an suspension for inhibiting the scarring of the filtration passage is basically the same.

Keywords： effective components of Qingguang'an; glaucoma; filtration scarring; collagen fibers; fibroblast- specific protein-1; connective tissue growth factor; transforming growth factor-β1; rabbits

青光眼致盲率高，目前治疗方式主要是进行滤过性手术，而滤过道瘢痕化是滤过性手术失败最主要的原因。尽管抗代谢药物如丝裂霉素C在手术中应用大大提高了手术成功率，但此类药物广泛作用于眼部组织，会导致滤过泡渗漏、眼内感染等一系列并发症，易给患者本来已损伤的视功能带来新的威胁[1-2]。本课题组自主研制的青光安颗粒剂具有活血化瘀、利水明目的功效，用于术后抗滤过道瘢痕化疗效显著[3-5]。前期通过在青光安颗粒剂中药组分库中建立高通量筛选药物体系[6-7]，已筛选出4种青光安有效组分。本实验将4种青光安有效组分、青光安混悬液及丝裂霉素C应用于手术动物模型，观察各组兔滤过道瘢痕组织中胶原纤维、成纤维细胞特异性蛋白-1（FSP-1）、结缔组织生长因子（CTGF）、转化生长因子-β1（TGF-β1）的表达及抑制瘢痕组织增生的效果，对比各有效组分抗滤过道瘢痕化的实际疗效，为研制治疗青光眼的药物提供依据。

1  实验材料

1.1  动物

SPF级新西兰长耳白兔48只，湖南中医药大学动物实验中心提供，体质量1.5～2.0 kg，雌雄各半，实验前排除双眼及全身病变。饲养于湖南中医药大学动物实验中心SPF级动物房，温度（23±2）℃，相对湿度50%～55%，自由摄食饮水。

1.2  药物

水合氯醛，上海国药集团;丝裂霉素C，上海士锋生物科技有限公司，货号A1400;青光安4种有效组分，湖南中医药大学药学院中药化学教研室;青光安（黄芪、赤芍、地龙、车前子、白术、茯苓等）颗粒，湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供，用灭菌蒸馏水配制成混悬液。

1.3  主要试剂与仪器

4%多聚甲醛，武汉博士德生物工程有限公司;兔抗人成纤维细胞特异性蛋白单克隆抗体，武汉赛维尔生物科技有限公司，批号GB11397;兔抗人结缔组织生长因子单克隆抗体，武汉赛维尔生物科技有限公司，批号GB11078;兔抗人转化生长因子单克隆抗体，武汉赛维尔生物科技有限公司，批号GB11271;SABC即用型试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司，批号SA1022;DAB试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司，批号SA2025。超低温冰箱（中科美菱，DW-HL538），立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂，YXQ-LS-SⅡ），净化工作台（苏州净化设备有限公司，SW-CJ-1D），电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司，101-1AB型），低温台式高速离心机（赫西仪器装备有限公司），超微量分光光度计（美国Nanodrop公司），凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司），微量移液器（德国Eppendorf公司），台式高速冷冻离心机（美国Thermo公司），水平电转槽（北京六一仪器厂，DYCP-40C），超纯水仪（美国Millipore公司），紫外可见分光光度计（上海Spectrum公司，SP-752），恒温摇床（常州金坛，THZ-82A），水平搖床（北京六一仪器厂，WD-9405B），扫描仪（日本Canon）。

2  实验方法

2.1  分组

实验兔按体质量随机分为空白组（A组）、模型组（手术对照组，B组）、丝裂霉素C组（C组）、有效组分1组（D组）、有效组分2组（E组）、有效组分3组（F组）、有效组分4组（G组）和青光安混悬液组（H组），每组6只。

2.2  造模

10%水合氯醛溶液（2～4 mL/kg）兔耳缘静脉注射麻醉，使用压陷式眼压计测每只兔术眼3次眼压，取平均值并记录。生理盐水冲洗术眼结膜囊后滴0.1%丁卡因进行局部麻醉，在手术显徼镜下行双眼小梁切除+虹膜根部切除术[8]。

2.3  给药

A、B组术后第l日开始给予生理盐水灌胃;C组术中切除巩膜和小梁组织前给予丝裂霉素C;D、E、F、G组术后第1日开始给予青光安不同组分，按体表面积折算等效剂量比值计算给药，溶于生理盐水;H组术后第1日开始给予成人临床等效剂量3.27倍青光安混悬液，溶于生理盐水。给药体积均为10 mL/kg，每日1次，连续4周。

2.4  术后眼压测量及取材

眼压参照文献[8]方法测量。灌胃4周后第1日取材，空气栓塞法处死兔，立即摘取眼球4%多聚甲醛固定[6]，剪取手术区10 mm×10 mm范围内的方形全层眼球壁及其周边组织，石蜡切片，备行Masson染色。

2.5  胶原纤维、成纤维细胞特异性蛋白-1、结缔组织生长因子和转化生长因子-β1的表达检测

取4份石蜡切片Masson染色，1份光镜400倍视野下随机选择5个高倍视野，观察胶原纤维占视野面积比值，另外3份各随机选取5个高倍视野分别测量FSP-1、CTGF、TGF-β1的平均光密度值。

3  统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以±s表示，组间比较用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4  结果

4.1  青光安有效组分对模型兔眼压的影响

同一时间不同组眼压情况：手术后各组眼压均明显下降，且手术后1周内各组均有抑制眼压的效果;手术后2周B、G组眼压基本恢复到术前水平;手术后4周C、E、F、H组手术效果依然存在，该4组所用药物对术后抑制眼压上升均有一定效果，其中以C组效果最好，F组较差。同一组不同时间段眼压情况：B组术后2、4周与术前比较差异无统计学意义（P>0.05），说明B组手术2周后眼压基本恢复到术前水平;C组术后各时间段与术前比较差异有统计学意义（P<0.05），说明C组在手术后眼压均处于较低水平;D组术后4周较术前差异无统计学意义（P>0.05），说明D组对抑制眼压上升无明显作用;E组术后各时间段相比术前差异有统计学意义（P<0.05），说明E组对抑制眼压上升有效;F组术后各时间段较术前差异均有统计学意义（P<0.05），说明F组对抑制眼压上升有效;G组术后各时间段较术前差异有统计学意义（P<0.05），说明G组对于抑制眼压上升有效;H组术后各时间段较术前差异有统计学意义（P<0.05），说明H组对抑制眼压上升有效。结果见表1。