U0126对TGF-β1诱导足细胞炎症因子分泌和miR-155表达的影响

郑心彤 古贤君 凌霄雁 梁钊 覃卿 杜秀日 林栩

【摘要】 目的 探讨细胞外调节蛋白激酶（erk）1/2通路抑制剂U0126对转化生长因子（transforming growth factor，TGF）β1诱导足细胞炎症因子分泌和微RNA（microRNA，miR）155表达的影响。方法 体外培养小鼠足细胞，随机分为正常对照组、TGFβ1组和TGFβ1+U0126组，使用Western blot法检测erk1/2磷酸化水平，ELISA法检测足细胞上清TNFα及IL6蛋白表达水平，RTqPCR法检测足细胞miR155表达水平。结果 与正常对照组相比，TGFβ1诱导足细胞后，erk1/2磷酸化水平明显上升，足细胞上清IL6和TNFα蛋白分泌增多，足细胞miR155表达显著上调，差异均有统计学意义（P<0.05）。与TGFβ1组相比，TGFβ1+U0126组erk1/2磷酸化水平被抑制，足细胞上清IL6和TNFα蛋白分泌减少，足细胞miR155表达下降，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 erk1/2通路抑制剂U0126可抑制足细胞炎症因子IL6、TNFα分泌，下调足细胞miR155的表达。

【关键词】 足细胞;U0126;IL6;TNFα;miR155

中图分类号：R692   文献标志码：A   DOI：10.3969/j.issn.10031383.2019.05.002

【Abstract】 Objective To investigate the effects of U0126，an extracellular regulated protein kinases（erk）1/2 pathway inhibitor，on inflammatory cytokine secretion and （microRNA，miR）155 expression in podocytes induced by （transforming growth factor，TGF）β1.Methods Mouse podocytes were cultured in vitro and randomly divided into normal control group，TGFβ1 group and TGFβ1+U0126 group.The erk1/2 phosphorylation level was detected by Western blot，the expressions of supernatant TNFα and IL6 were detected by ELISA，and the miR155 expression in podocyte was detected by RTqPCR.Results Compared with the normal control group，the phosphorylation level of erk1/2 significantly increased，the secretion of supernatant IL6 and TNFα protein increased，and the expression of miR155 in podocytes significantly upregulated after TGFβ1 inducement，difference was statistically significant（P<0.05）.Compared with the TGFβ1 group，the phosphorylation level of erk1/2 in TGFβ1+U0126 group was inhibited，the secretions of IL6 and TNFα protein in podocyte supernatant decreased，and the miR155 expression in podocyte decreased，difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion erk1/2 pathway inhibitor U0126 can inhibit the secretions of inflammatory factors such as IL6 and TNFα，and downregulate miR155 expression in podocyte.

【Key words】 podocyte;U0126;IL6;TNFα;miR155

足细胞数量和功能的异常可导致大量蛋白尿，并发展为足细胞病。微小病变性肾病、膜性肾病和局灶节段性肾小球硬化症等在内的许多肾小球疾病均可出现足细胞损伤，如不及时给予有效的治疗，最终可发展为慢性肾脏病[1]。目前足细胞病的治疗主要为免疫干预及对症支持治疗。免疫干预治疗多数药物副作用较大，没有针对性，疗效不一。细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，erk）1/2信号通路的主要功能是将细胞表面的信号受体传导至细胞核中，对细胞增殖及凋亡等过程具有调控作用。有研究表明，erk1/2通路的激活与单核细胞炎症免疫反应有关，并介导调控了单核细胞黏附、吞噬和杀伤能力[2]。本课题组前期研究探索了转化生长因子（transforming growth factor，TGF）β1通过线粒體凋亡途径诱导足细胞凋亡的分子机制[3]。本次实验，我们继续使用TGFβ1诱导足细胞损伤模型，应用erk1/2通路抑制剂U0126，研究U0126对TGFβ1诱导足细胞炎症因子分泌和微RNA（microRNA，miR）155表达的影响，探讨该通路作为肾小球疾病治疗靶点的可行性。

1 材料与方法1.1 主要试剂 RPMI1640培养基（C11875500BT，Gibco）、优级胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，SA21201，兰州Cellmax）、PBS缓冲液（P1020500，北京Solarbio）、TGFβ1（96100212，美国PeproTech）、U0126（S1102，美国Selleck）、蛋白酶抑制剂混悬液（CW2200S，北京康为世纪）、磷酸酶抑制剂混悬液（CW2383S，北京康为世纪）、RIPA裂解液（P0010S，上海碧云天公司）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0010S，上海碧云天公司）、perk1/2（#4370，美国CST）、erk1/2抗体（#9102，美国CST）、GAPDH抗体（104941AP，美国Proteintech）、RNAiso Plus（9108，日本TaKaRa）、小鼠白介素（interleukin，IL）6 ELISA Kit（CSBE04639m，武汉华美公司）、小鼠肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）α ELISA Kit（CSBE04741m，武汉华美公司）、MirXTM miRNA FirstStrand Synthesis and SYBR qRTPCR（638315，美国Clontech Laboratories）、SYBRR Premix Ex TaqTM Ⅱ （Tli RNaseH Plus，RR820A，日本TaKaRa）。

1.2 细胞培养 条件永生化小鼠足细胞购于复旦大学细胞中心，培养条件参考本课题组前期研究，并适当优化[4]。培养使用1640培养基（含10% FBS），细胞在5% CO2，37℃培养箱中进行培养，每2天传代一次。细胞复苏后，传代培养14天左右分化成熟后进行后续试验。

1.3 实验种板及分组 实验前一天将分化成熟的足细胞以5×104个/孔接种于6孔板中，每组设置3个平行孔，加入2 mL 含10% FBS的1640培养基。当细胞贴壁生长至70%融合时，加入含1% FBS的1640培养基同步化24小时，之后根据实验设计加入相应处理试剂进行实验。细胞随机设为：正常对照组、TGFβ1组和TGFβ1+U0126组。后两组使用12 ng/mL TGFβ1诱导足细胞，其中，TGFβ1+U0126组给予20 nM U0126;正常对照组给予等体积含10% FBS的1640培养基。

1.4 Western blot法检测erk1/2的磷酸化水平 倒去6孔板中的细胞培养液，使用预冷的PBS缓冲液清洗3次，每孔加入100 μL 含1×蛋白酶抑制剂混悬液和1×磷酸酶抑制剂混悬液的RIPA裂解液，小心吹打混匀后冰浴裂解30分钟，收集含细胞悬液至1.5 mL EP管中，4℃ 10 000 rpm离心10分钟，收集含总蛋白的上清液。按BCA蛋白定量说明书操作测定总蛋白浓度，并使用RIPA裂解液调整蛋白浓度，将提取的总蛋白与5×SDS上样缓冲液按比例配制，使其稀释为1×SDS上样缓冲液，在沸腾的水浴锅中煮5分钟使蛋白变性。每孔加入40 μg总蛋白进行SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳，湿转至PVDF膜，PVDF膜经封闭液室温封闭1小时后，分别用兔抗鼠perk1/2（1∶2000）、兔抗鼠erk1/2抗体（1∶1000）、兔抗鼠GAPDH抗体（1∶2000）4℃摇床孵育过夜。次日，TBST洗膜10分鐘，重复3次后，加入辣根过氧化物酶标记的相应二抗，室温孵育1小时，TBST洗膜10分钟，重复3次。按ECL化学发光试剂盒说明，使用凝胶成像系统显影，目的条带以Image J软件测定灰度值。

1.5 酶联免疫吸附测定（Enzymelinked Immunosorbent Assay，ELISA）法检测足细胞上清TNFα及IL6蛋白表达 收集6孔板中的细胞培养液上清，3500 rpm离心15 分钟后取上清分装，稀释两倍后进行后续检测。待ELISA试剂盒升至室温后，取出96孔加样板，每孔加入标准品和待测样品100 μL，小心混匀后室温摇床上反应2小时。吸去孔内液体后，每孔加入100 μL 1×生物素化抗体，室温摇床上反应1小时，吸去孔内液体并甩干，每孔加入200 μL 1×洗涤工作液静置2分钟，充分甩干，重复3次。吸去孔内液体后，每孔加入100 μL 1×辣根过氧化物酶标记结合物工作液，置于37℃温箱中，摇床上反应1小时，吸去孔内液体并甩干，每孔加入200 μL 1×洗涤工作液静置2分钟，充分甩干，重复5次。每孔加入90 μL底物溶液室温反应30分钟后，加入50 μL种终止液，5分钟内测定OD450及OD590。

1.6 实时荧光定量PCR（Realtime Quantitative Polymerase Chain Reaction，RTqPCR）法检测足细胞miR155的表达 按TaKaRa RNAiso Plus 总RNA提取试剂盒说明提取RNA，电泳检测总RNA的完整性，紫外分光光度计检测总RNA浓度。取1 μg总RNA进行逆转录，按逆转录试剂盒配制反应体系。U6引物由Clontech逆转录试剂盒提供，miR155引物由吉玛公司合成并验证。实时荧光定量PCR反应总体系为20 μL，每个样本重复3次，以U6作为管家基因，采用2△△CT法计算miR155的相对表达量。

1.7 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，经正态分布检验及方差齐性检验，计量资料均符合正态分布、方差齐，以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，检验水准：α=005，双侧检验。

2 结  果2.1 U0126对TGFβ1诱导足细胞磷酸化erk1/2水平的影响 Western blot法检测结果表明，TGFβ1可诱导足细胞erk1/2磷酸化水平明显增高，磷酸化erk1/2与erk1/2灰度值之比为（1.09±0.10），U0126处理足细胞后，erk1/2磷酸化水平则被明显抑制，灰度值之比为（0.51±0.04），但均高于正常对照组的灰度值之比（0.35±0.03），差异有统计学意义（P<005）。见图1。

2.2 U0126对TGFβ1诱导足细胞炎症因子释放的影响 ELISA法检测足细胞上清IL6及TNFα蛋白的表达。TGFβ1诱导足细胞后，细胞上清液中IL6蛋白表达水平为（56.67±1.51）ng/mL，与正常对照组（14.59±0.76）ng/mL相比明显增加;而使用U0126抑制剂后，TGFβ1诱导增加的IL6蛋白表达水平出现下降，为（31.43±1.71）ng/mL，但仍高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。细胞上清中TNFα蛋白表达水平也检测到与IL6蛋白相同的变化趋势，正常对照组为（23.29±1.28）ng/mL，表达较低，TGFβ1组为（83.62±2.67）ng/mL，较正常对照组明显升高，TGFβ1+U0126组TNFα蛋白表达水平下降，为（68.16±1.40）ng/mL，但高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。

2.3 U0126对TGFβ1诱导足细胞miR155表达水平的影响 RTqPCR法检测足细胞miR155表达水平的变化。结果显示，与正常对照组相比，TGFβ1诱导足细胞使miR155的表達水平升高（2.27±020）倍;U0126处理足细胞后，下调了miR155的表达，但仍为正常对照组的（1.94±0.06）倍，差异有统计学意义（P<0.05）。见图3。

3 讨  论  足细胞是位于肾小囊壁内的脏层上皮细胞，环绕着肾小球毛细血管，足细胞向外伸展的足突相互交错，形成了具有滤过功能的裂孔隔膜，是肾小球滤过屏障的重要组成部分。Guo等人[5]通过建立转基因小鼠模型证实，特异性减轻足细胞损伤，不仅能减缓肾小球硬化、减轻肾小管间质纤维化，还能改善总生存率。这提示我们，足细胞损伤不仅参与了许多肾小球疾病的发病过程，还影响着疾病的发展和预后，针对足细胞特异性药物的研究具有重要的临床应用价值。TGFβ1是属于转化生长因子家族β超家族的多功能细胞因子，广泛参与了细胞增殖、生长、分化、凋亡等过程。有报道表明，TGFβ1可能通过增加雷帕霉素靶蛋白1表达及下游因子的磷酸化，参与诱导了足细胞凋亡的过程，但其具体作用机制仍不明确[6]。本课题组前期研究已证实，12 ng/mL TGFβ1能抑制足细胞增殖，下调足细胞特异性蛋白nephrin的表达，从而有效诱导足细胞损伤[7]。本次研究，我们使用TGFβ1诱导体外培养的足细胞，并应用erk1/2通路抑制剂U0126进行干预，观察U0126的应用对炎症因子释放和miR155表达的影响，探讨足细胞免疫炎症性损伤的分子机制。

在细胞损伤应激的过程中，常常由多条信号转导通路介导，影响着细胞损伤的过程，erk1/2为信号通路的关键因子，也是许多药物治疗的重要靶点。在许多肾小球疾病中，均可出现erk1/2磷酸化水平的升高。Mouawad等人[8]研究发现，膜性肾病小鼠模型中，erk1/2通路被激活，并且与足细胞肌动蛋白骨架结构破坏有关。Zhu等人[9]则抑制erk1/2通路的活性，观察到系膜细胞增殖相关基因的表达也出现改变，影响了系膜增生性肾炎的进展。此外，erk1/2磷酸化的水平与炎症反应密切相关，在急进性肾小球肾炎中，erk1/2的活化不仅影响系膜细胞增生，还参与调控巨噬细胞浸润[10]。本次研究结果表明，TGFβ1诱导足细胞后，erk1/2磷酸化的水平显著升高，erk1/2通路被激活，这证实erk1/2通路参与了TGFβ1诱导的足细胞损伤，而其调控作用的机制，我们将进一步设计实验对其进行研究。

免疫性肾小球疾病的发病过程中，常伴随着炎症因子的产生，并继发一系列炎症反应。局灶节段性肾小球硬化的患者体内，活化T细胞核因子1介导了TNFα的分泌，诱发游离胆固醇依赖性足细胞凋亡，影响了疾病的进展[11]。在糖尿病肾病中，炎性因子IL6、TNFα释放增加可诱发内质网应激，从而导致足细胞损伤[12]。还有研究表明，霉酚酸酯、他克莫司和类固醇联合治疗狼疮性肾炎时，可强烈抑制IL6途径，有助于稳定足细胞骨架结构，因而表现出比常规治疗更好的疗效[13]。因此，炎症免疫反应是肾小球疾病发病的主要因素之一，研究U0126对TGFβ1诱导足细胞炎症因子的影响具有重要意义。我们的实验结果发现，TGFβ1诱导足细胞可显著增加炎症因子IL6、TNFα的释放，引起足细胞炎症应激反应，进一步应用U0126抑制erk1/2通路后，炎症因子释放减少，提示erk1/2通路参与调节TGFβ1诱导足细胞损伤过程中的炎症反应，U0126的使用可减轻这一应激反应。

MiR155为非编码微小RNA，在病理生理过程中，miRNA通过与靶基因结合在转录后水平调节着基因表达，参与了许多疾病的发病机制，并且有望成为新的诊断标志物。Muller等人[14]对不同肾小球疾病患者的尿液和体外培养的足细胞、肾小球内皮细胞、肾小球系膜细胞、肾小管细胞中miRNA的表达进行筛选，发现miR155表达显著上调，有望成为肾小球疾病相关的新型诊断指标，但其具体机制有待进一步研究。众所周知，miR155与免疫调节功能密切相关，不仅对免疫细胞具有调节作用，还能影响免疫炎症相关的信号转导通路调节炎症介质的表达。因此我们推测，miR155可能参与了U0126抑制TGFβ1诱导足细胞炎症反应的过程。本次研究我们发现，正常足细胞miR155的表达水平较低，TGFβ1干预后miR155的表达水平明显上调，进一步实验发现，应用U0126可下调TGFβ1诱导升高的miR155表达。这说明，miR155与U0126影响TGFβ1诱导足细胞损伤的机制关系密切，值得我们对其进行深入研究。

综上所述，我们发现erk1/2在TGFβ1诱导足细胞损伤的过程中被明显激活，U0126的应用抑制了erk1/2通路，使炎症因子IL6、TNFα释放减少，miR155表达水平降低，从而减轻了TGFβ1诱导足细胞引起的炎症应激反应。本研究有望为肾小球疾病足细胞损伤的治疗提供新策略。