siRNA干扰TWSG1表达对SGC-7901细胞增殖的影响*

吴佳艳,袁静怡,曾嘉丽,刘 玥,3△

(1.南方医科大学基础医学院，广州 510515；2.南京医科大学基础医学院，南京 210000；3.广东省单细胞技术与应用重点实验室，广州 510515)

日前，扭转原肠胚形成同系物1(twisted gastrulation protein homolog1，TWSG1)与骨骼、肾脏、胆管等相关癌症密切相关[4-5]。现有研究表明，TWSG1基因直接影响到骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)以及相关信号通路。TWSG1基因沉默对生物(斑马鱼)的发育有显著影响，TWSG1基因的激活或者沉默在不同器官中可能有不同的效应[4]。但目前对TWSG1在胃癌中的研究甚少。RNA干扰(RNA interference，RNAi)指由RNA诱发基因沉默[6]。RNA干扰技术因其高特异性、高效性、长效性，在肿瘤的临床治疗中的应用越来越多[7]。本研究使用siRNA干扰人胃癌细胞SGC-7901中的TWSG1基因，观察其对SGC-7901细胞株增殖与凋亡的影响，为探寻新的有效治疗胃癌的方法提供实验基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞 人胃癌细胞株SGC-7901由南方医院中心实验室提供，于DMEM完全培养基中培养(内含10%的胎牛血清，100 μg/mL链霉素，100 U/mL青霉素)。所有细胞均置于37 ℃，含5%二氧化碳的培养箱中培养，换液情况视细胞贴壁生长情况而定，待细胞达到合适的密度，用胰酶消化传代。

1.1.2仪器 离心机(美国Beckman公司)； Infinite M200酶标仪(瑞士Tecan公司)；Nano Drop2000超微量分光光度计(Thermo公司)；小型水平电泳仪(美国Bio-Rad公司)；Mini-Protean Tetra电泳系统(美国Bio-Rad公司)；Eclipse Ti-s荧光倒置显微镜(日本Nikon公司)；7500Real-Time PCR仪(美国Applied Biosystems公司)；Biorad MJ Mini 梯度PCR仪(美国Bio-Rad公司)；HF90二氧化碳培养箱(中国力康生物医疗科技控股有限公司)；流式细胞仪(美国BD公司)。

1.1.3药品与试剂 SGC-7901细胞(南方医院中心实验室提供)，pLVX-shRNA1质粒(本室保存)，DEME培养基、胎牛血清、PBS、胰蛋白酶、链霉素和青霉素(美国Gibico公司)，嘌呤霉素(美国Sigma公司)，Lipofectamine 2000、Trizol(Invitrogen公司)，Prime Script RT reagent Kit 、SYBR Premix Ex Taq TMⅡKit(Takara公司)，RIPA细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)，PVDF膜(Millipore公司)，TWSG1兔抗人多克隆抗体(Abcam公司)，HRP标记的羊抗兔IgG(北京天德悦公司)，ECL发光液(美国Thermo Scientific Pierce公司)，CCK8(日本Dojindo公司)，Annexin V-FITC和PI(江苏凯基生物技术股份有限公司)，引物和siRNA(上海生工生物股份有限公司合成)。

1.2方法

1.2.1siRNA干扰TWSG1表达后筛选稳定表达的细胞株 使用siDirect针对TWSG1基因设计siRNA并合成，与载体连接。实验组分为3组：空白对照组(SGC-7901细胞)、阴性对照组(转染空载体,7901-vector)、siRNA干扰组(转染连接siRNA的载体,7901-siRNA1、7901-siRNA2、7901-siRNA3)。转染筛选后采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot分别鉴定mRNA和蛋白，鉴定干扰效果显著后进行后续实验。

1.2.2RT-PCR检测TWSG1 mRNA表达 采用Trizol提取收集的各组细胞RNA。采用Prime Script RT reagent Kit制备cDNA，采用RT-PCR以GAPDH为内参检测TWSG1 mRNA的表达水平。

1.2.3Western blot检测TWSG1蛋白表达 取对数生长期的细胞用胰酶消化后，RIPA裂解液提取蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度。用10%丙烯酰胺凝胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。低温下用湿转法转膜，免疫印迹后进行曝光，利用凝胶成像系统采集并分析图像。

比如，有些词语，从表面解释较为理性，这时，教师应引导学生用感性的方式去突破这种客观限制，正所谓“条条大路通罗马”。如人教版第十册《我的伯父鲁迅先生》中，在救助车夫这个片段中，有个词——“饱经风霜”，如果只是照搬词典的意思，显然理解起来是苍白的。如果能让学生走进生活去理解这个词，说说生活中，你看过的饱经风霜的脸，显然这样更能帮助学生走进文本，去感受车夫遭受的困境。通过这种的学习方式，“饱经风霜”这个词在情感上体会得更加深刻，深入到学生们的精神世界中。

1.2.4CCK8检测细胞增殖 在96孔板按照1 000个细胞/孔接种SGC-7901细胞，分为空白对照组、阴性对照组和siRNA干扰组各3孔。分别于培养箱培养24、48 h以及72 h时，加入CCK8检测试剂。培养箱继续培养4 h，测定450 nm吸光度(OD值)值。绘制细胞增殖曲线。

1.2.5AnnexinV-FITC/PI染色法进行细胞周期检测 PBS洗涤转移下的细胞，用染色结合液制成单细胞悬液，再加入染色液，轻柔涡旋混匀，室温避光孵育，最后用流式细胞仪进行检测。

1.3统计学处理 采用SPSS19.0软件进行统计学分析，实验结果采用ANOVA进行分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1siRNA干扰TWSG1 mRNA表达效率 siRNA干扰TWSG1 mRNA表达高(P<0.05)，RT-PCR检测mRNA表达结果见图1。

图1 干扰后各组细胞中TWSG1mRNA的表达

表1 干扰后各组细胞中TWSG1蛋白的相对灰度值

*：P<0.05 ，与空白对照组比较;#：P<0.05 ，与阴性对照组比较

2.2siRNA干扰组TWSG1的蛋白表达低 各组细胞Western blot检测结果显示(图2，表1)，siRNA干扰组中TWSG1蛋白表达受到抑制(P<0.05)，7901-siRNA1尤其显著。结合PCR结果，可认为成功构建了siRNA干扰TWSG1表达模型。

1:空白对照组；2:阴性对照组；3:7901-siRNA1组；4:7901-siRNA2组；5:7901-siRNA3组

图2干扰后各组细胞中TWSG1蛋白的表达

2.3siRNA干扰TWSG1基因表达促进SGC-7901细胞增殖 用CCK8检测各组增殖情况，以24 h为基础，在48、72 h时，siRNA干扰组SGC-7901细胞分别增殖339%、850%； 而空白对照组仅增殖173%、644%。SiRNA干扰组SGC-7901细胞的增殖与其他两组比较显著增加(P<0.05)，见图3。

2.4siRNA干扰组后细胞周期的变化 siRNA干扰TWSG1基因表达促进SGC-7901细胞增殖，更高比例的细胞从G1期进入S期,见图4。

图3 干扰后各组细胞的生长曲线

*：P<0.05，与空白对照组、阴性对照组比较

图4 siRNA干扰后细胞在不同时期的百分比

3 讨 论

研究表明TWSG1基因编码保守疏水蛋白，调控BMP信号通路[4-5]。目前大部分研究是通过BMP通路探讨TWSG1表达与铁调素表达的关系；也有研究表明TWSG1基因沉默将导致生物发生障碍或缺陷，小鼠与斑马鱼等试验均证实这一观点[4-5]，可见TWSG1是一个关键基因。现有文献提示TWSG1对不同器官的肿瘤具有双向性调控：在结肠癌中可能是抑癌基因[8-9]；在乳腺癌中有促进肿瘤发生的功能[10]。临床发现家族性结肠癌患者均有TWSG1缺失或表达低下[9]，细胞学实验也显示TWSG1对结肠癌有抑制作用。推测TWSG1在结肠癌中是抑癌作用，在信号通路中，TWSG1是一种富含亮氨酸的分泌蛋白，与BMP结合蛋白作用，通过USP53途径抑制细胞增殖。以TWSG1促进乳腺癌发生为例，TWSG1是BMP的结合蛋白，调节细胞外的BMP2、BMP4、BMP7等配体[11]。青春期时在肌上皮和终末芽体细胞中均可表达TWSG1，在导管成熟后，主要表达限于肌上皮层。TWSG1的全缺失导致导管伸长延迟，二级分支减少，末端芽增大，这与腔上皮细胞数量的增加和细胞凋亡的减少有关。在胚胎乳腺发育中，当BMP靶基因的表达降低、BMP信号传导降低的同时，pSMAD1、5、8水平也对应降低。管腔特异性的GATA-3在TWSG1-/-胚胎乳腺中减少。TWSG1对BMP信号传导的调节使正常导管伸长，导管进行分支，管腔形成和出生后胚胎乳腺中的肌上皮区室化。总之，TWSG1启动子区域中CpG岛的异常甲基化可能在暴露于不利条件时会促进肿瘤细胞活力或分化，最终导致肿瘤。为何一个基因，在不同组织里却有截然不同的作用呢？这还要从TWSG1与BMP之间的关系入手。TWSG1与BMP结合蛋白相互作用，TWSG1可以作为BMP拮抗剂[12]和激动剂[13]。BMP对癌症有一定的抑制作用[14-15]，由于TWSG1对BMP的不同作用，导致了TWSG1在不同组织里有促进或抑制癌症的功能。本研究结果提示TWSG1极可能是BMP激动剂，siRNA干扰TWSG1后其表达下调，与BMP作用弱化，使SGC-7901细胞株增殖。

本研究重点研究了TWSG1表达异常对SGC-7901增殖的影响。在培养48、72 h时，在siRNA诱导低表达TWSG1调控下的SGC-7901的增殖速度是空白对照组的1.96、1.32倍。实验数据表明，siRNA干扰使TWSG1表达下调，低表达的TWSG1促进SGC-7901的增殖。TWSG1对SGC-7901的增殖能力有显著影响。

总之，本研究的结果表明siRNA干扰TWSG1基因表达将对人胃癌细胞SGC-7901的增殖产生明显影响，有显著促进作用。TWSG1很可能是一种抑癌基因，提示TWSG1基因可能是潜在的胃癌治疗靶点。此外由于胃癌与TWSG1的相关研究较少，因此本研究对后续TWSG1基因在胃癌中的功能、分子机制的研究具有重大意义，为胃癌发展的机制研究提供了实验基础，为胃癌的个性化治疗以及基因治疗提供了实验依据。通过基因筛查可以预判出胃癌高危人群，在临床治疗上未尝不是一种有效治疗手段。