H2O2诱导建立HTR-8/SVneo胎盘滋养细胞氧化应激模型

李美和，党慧敏，刘艳巧，吴晓玲，刘润侠，安 鹏

(1.西安交通大学医学院第二附属医院中医科；2.妇产科，陕西 西安 710004)

氧化应激(oxidative stress)是指活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)生成超出了机体内抗氧化防御能力的不平衡状态。过量的活性氧会损害细胞的脂类、蛋白质或DNA，抑制其正常功能。因此，氧化应激与许多人类疾病都有关系。越来越多的证据显示，氧化应激与流产、子痫前期等病理性妊娠的发生有密切关系[1-3]。在正常妊娠过程中，机体的氧化和抗氧化功能二者保持相对平衡，不会产生氧化应激[4-5]。然而，由于任何原因引起的人滋养细胞氧化损伤，都会使其增殖和侵袭能力下降，胎盘形成和发育异常，最终发生病理妊娠[6]。

人胎盘滋养HTR-8/SVneo细胞系是一种永生化的滋养细胞株，与人类原代滋养细胞具有许多相似的特性。因人类原代滋养细胞在培养过程中不能维持很长时间，故HTR-8/SVneo细胞系已成为研究胎盘功能和妊娠相关疾病的有用工具。本资料选取此细胞系作为研究对象，试图通过采用不同浓度及不同时间的过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)诱导滋养细胞发生氧化应激，找到建立HTR-8/SVneo人胎盘滋养细胞氧化应激模型的最佳条件，为研究人类妊娠病理性疾病奠定良好的基础。

1材料与方法

1.1材料及仪器

2017年11月至2018年2月于西安交通大学第一附属医院进行实验，本研究采用一种永生化、孕早期、绒毛外滋养层细胞系HTR-8/SVneo(由加拿大安大略省皇后大学Charles Graham博士提供)。

DMEM/F12培养基、胎牛血清、青链霉素混合液及0.25%胰酶购于美国GIBCO公司。H2O2购于美国Sigma-Aldrich公司；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、丙二醛(malonic dialdehyde，MDA)及过氧化氢酶(catalase，CAT)试剂盒购于南京建成生物工程研究所有限公司；细胞增殖-毒性检测试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)购自日本株式会社上海同仁化学研究所；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)测试盒购于碧云天生物技术研究所；超氧化物阴离子荧光探针(dihydroethidium，DHE)购于英国Abcam公司；PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I细胞凋亡检测试剂盒购于美国BD公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养与处理

在DMEM/F12培养基中对HTR-8/SVneo细胞进行培养，加入10%灭活的胎牛血清和1%青链霉素混合液，在37°C、5%CO2中培养至细胞状态良好时进行下一步实验。

1.2.2细胞形态观察

取对数生长期的HTR-8/SVneo细胞，以每孔1×105细胞种植于6孔培养板，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。24h后，实验组分别给予不同终浓度的H2O2，分为50μmol/L H2O2组、150μmol/L H2O2组、300μmol/L H2O2组和500μmol/L H2O2组；同时设立对照组，相同实验条件下分别继续培养1、3、6、12h，弃培养上清，PBS洗2遍，即放于相差倒置显微镜下，于相同的物镜倍数(10×)观察细胞形态学改变并拍照。

1.2.3 CCK-8法检测细胞存活率

前期实验条件同1.2.2内容，后弃培养上清，PBS洗2遍，加入提前配制的CCK-8工作液110μL(CCK-8溶液与培养基体积比为1：10)，置于37℃培养箱继续孵育2h，在自动酶标仪上检测450nm波长处各孔吸光度(OD)值。按下述公式计算细胞存活率：存活率(%)=(实验组OD-空白孔OD)/(对照组OD-空白孔OD)×100%

1.2.4流式细胞仪检测细胞凋亡

前期实验条件同1.2.2内容，后弃培养上清，冰冷的PBS洗2遍，用0.25%胰酶消化，收集细胞，800r/min离心5min，用100μL 1×loading buffer结合缓冲液重悬，分别加入5μL Annexin-V PE和5μL 7-AAD，混匀，室温避光孵育15min，加入400μL 1×结合缓冲液，样品置于冰上，1h内用流式细胞仪(FACScanTM；Becton Dickinson Bioscience，加利福尼亚州圣何塞)检测细胞凋亡情况。细胞分析采用配备的CellQuestTM软件(Becton Dickinson生物科学)。

1.2.5 DHE荧光探针检测细胞内ROS水平

前期实验条件同1.2.2内容，后弃培养上清，冰冷的PBS洗2遍，用1mL DHE(5μmol/L)重悬，37℃避光孵育30min，800r/min离心3min，冰冷的PBS洗2遍，用200μL PBS重悬，在流式细胞仪上进行检测。用平均荧光强度(mean flourscenceindensity，MFI)表示ROS水平。

1.2.6检测细胞培养上清中LDH含量及匀浆中SOD、CAT和MDA活性

前期实验条件同1.2.2内容，后吸取培养上清，随后按试剂盒说明检测细胞培养上清中LDH含量及细胞匀浆中SOD、CAT及MDA活性。

1.3统计学方法

2结果

2.1 CCK-8法检测H2O2对HTR-8/SVneo细胞活力的影响

HTR-8/SVneo细胞50μmol/L在H2O2作用1、3、6h后，细胞存活率分别为103.48%、101.68%、96.79%；150μmol/L在H2O2作用1、3、6h后，细胞存活率分别94.69%、96.4%、88.17%，较对照组100%的存活率无明显变化(P值分别为0.99、1.00、0.98、0.86、1.00、0.55)。与对照组100%相比，50μmol/L在H2O2作用12h后细胞存活率有所下降(80.74%)(*P<0.05)；300μmol/L在H2O2作用6、12h及500μmol/L在H2O2作用3、6、12h后，细胞损伤较重，且500μmol/L在H2O2作用后随着时间增加，细胞损伤有加重趋势，细胞存活率下降，分别为42.3%、32.77%、23.59%、12.85%；300μmol/L在H2O2作用3h后细胞存活率为76.78%，与对照组100%比较，细胞存活率明显降低(F=7.793，**P<0.01)，既达到细胞损伤状态，又存有一定的细胞活力，符合细胞实验研究条件要求，见图1。

图1CCK-8法检测H2O2对HTR-8/SVneo细胞存活率的影响

Fig.1EffectofH2O2onHTR-8/SVneocelllineactivityusing CCK-8method

2.2 HTR-8/SVneo细胞形态学观察

50、150μmol/L H2O2组HTR-8/SVneo细胞形态无明显改变，细胞形态结构正常、细胞轮廓清晰；300μmol/L H2O2组HTR-8/SVneo细胞形态发生改变，细胞皱缩、间隙增宽，有些呈片状坏死脱落，但仍存活相对较多细胞；500μmol/L H2O2组HTR-8/SVneo细胞形态发生明显改变，细胞皱缩变圆，间隙增大，体积变小相应减少，贴壁细胞明显减少，大部分呈片状坏死脱落，存活细胞较少，见图2。

图2不同浓度3h的H2O2作用HTR-8/Svneo细胞的形态的影响

Fig.2EffectofdifferentconcentrationsofH2O2oncellmorphologyafterculturingfor3hours

2.3流式细胞仪检测H2O2对HTR-8/SVneo细胞凋亡的影响

与对照组2.35%比较，50、150μmol/L在H2O2作用1、3、6h引起的HTR-8/SVneo细胞凋亡率仅有轻度增加(50μmol/L 1、3、6h细胞凋亡率分别为4.15%、5.18%、5.23%，150μmol/L 1、3、6h细胞凋亡率分别为4.91%、5.25%、6.15%)，经比较差异均无统计学意义(P值分别为1.00、0.89、0.29、1.00、0.86、0.06)；随作用时间延长，300μmol/L H2O2组的细胞凋亡率不断增加(均**P=0.00<0.01)，其中300μmol/L在H2O2作用3h细胞凋亡率为25.05%，而300μmol/L在H2O2作用6、12h及500μmol/L在H2O2作用3、6、12h引起的细胞凋亡率呈快速上升趋势(300μmol/L 6、12h细胞凋亡率分别为25.02%、39.05%，500μmol/L 3、6、12h细胞凋亡率分别为29.23%、44.05%、44.24%)，虽然与对照组2.35%相比有显著差异(F=196.500，均**P=0.00<0.01)，但是其凋亡率较高，该处理对细胞损伤较大，导致细胞坏死，无法进一步研究使用，见图3。

注：A图中，Control为对照组；A1～A4为50μmol/L在H2O2作用1、3、6、12h情况；B1～B4为150μmol/L在H2O2作用1、3、6、12h情况；C1～C4为300μmol/L在H2O2作用1、3、6、12h情况；D1～D4为500μmol/L在H2O2作用1、3、6、12h情况。B图为各组细胞存活率的定量分析。

图3流式细胞术检测H2O2对HTR-8/SVneo细胞凋亡的影响

Fig.3EffectofH2O2oncellapoptosisofHTR-8/SVneocellusingflowcytometry

2.4 DHE荧光探针检测H2O2对HTR-8/SVneo细胞内ROS水平的影响

与对照组相比，H2O2对HTR-8/SVneo细胞MFI水平的影响呈现出明显的浓度和时间依赖性。与对照组12.63比较，50μmol/L及150μmol/L在H2O2作用1、3、6h，细胞MFI升高不明显(50μmol/L 1、3、6h ，MFI值分别为12.76、13.59、15.50，150μmol/L 1、3、6h，MFI值分别为15.41、15.99、16.86)P值分别为1.00、0.72、0.66、0.77、0.56、0.41，均P>0.05 )，300μmol/L在H2O2作用3h的细胞MFI(17.95)明显高于对照组的12.63(F=325.300，**P=0.00<0.01)，但300μmol/L在H2O2作用6、12h，细胞MFI分别为19.24、24.11及500μmol/L在H2O2作用3、6、12h，细胞MFI分别为19.82、34.57、42.26，造成大部分细胞死亡，细胞还存有很大的活力，有利于下一步的实验，见图4。

A

B

注：A图中，Control为对照组；A1～A4为50μmol/L在H2O2作用1、3、6、12h情况；B1～B4为150μmol/L在H2O2作用1、3、6、12h情况；C1～C4为300μmol/L在H2O2作用1、3、6、12h情况；D1～D4为500μmol/L在H2O2作用1、3、6、12h情况。B图为各组细胞内超氧化物阴离子定量分析。

图4DHE荧光探针检测H2O2对HTR-8/SVneo细胞内ROS水平的影响

Fig.4EffectofH2O2onintracellularROSlevelofHTR-8/SVneocellusingDHEfluorescenceprobe

2.5 H2O2对HTR-8/SVneo细胞内SOD、MDA、CAT活力的影响及上清液中LDH活力的影响

与SOD为31.32、LDH为355、MDA为1.20、CAT为16.87相比，50、150μmol/L在H2O2作用1、3、6h的HTR-8/SVneo细胞分别为1.21、1.35、2.68、1.38、2.36、3.54(P值分别为1.00、0.22、0.13、0.99、0.21、0.06，均P>0.05)和LDH分别为401、475、505、546、566、637水平升高不显著(P值分别为1.00、0.29、0.19、0.99、0.24、0.10，均P>0.05)，抗氧化SOD分别为30.78、27.33、25.27、23.57、23.27、20.34(P值分别为0.99、0.21、0.06、0.97、0.93、0.31，均P>0.05)，CAT含量为17.21、16.34、14.25、13.24、10.01、9.87降低不明显(P值分别为0.55、0.64、0.78、0.37、0.19、0.07，均P>0.05)；与对照组相比，300μmol/L H2O2作用3、6、12h，500μmol/L H2O2作用3、6、12h均明显降低了细胞培养上清液中SOD、CAT的活性，同时升高了MDA和LDH水平的表达(SOD分别为14.34、10.01、9.88、9.55、7.22、5.87；LDH分别为628、688、715、742、809、880；MDA分别为4.30、4.55、5.27、5.25、5.83、6.10；CAT分别为5.68、5.01、4.33、6.00、4.01、3.21)(SOD：F=12.210，LDH：F=11.830，MDA：F=12.730，CAT：F=17.720，均**P=0.00<0.01)，其中300μmol/L H2O2组作用3h，细胞中LDH为628.00、MDA为4.30，含量升高明显，细胞培养上清液中SOD活性为14.37、CAT活性为5.68，但与6、12h及500μmol/L作用3、6、12h相比，其严重损伤水平较低，见图5。

注：A为H2O2对HTR-8/SVneo细胞内SOD活性的影响；B为H2O2对HTR-8/SVneo细胞内LDH含量的影响；C为H2O2对 HTR-8/SVneo细胞内MDA水平的影响；D为H2O2对HTR-8/SVneo细胞内CAT水平的影响。

图5H2O2对HTR-8/SVneo细胞内SOD活性、LDH含量及MDA和CAT水平的影响

Fig.5EffectofH2O2onintracellularSOD,LDH,MDAandCATlevelsinHTR8-SVneocell

3讨论

成功妊娠是一个非常复杂的过程，不仅需要母体免疫系统不排斥作为同种移植物的胎儿，还需要早孕期滋养细胞具有尤为重要的生理学功能，其中滋养细胞增殖与侵袭功能的正常发挥对于囊胚植入、胎盘的形成并建立合适的母-胎关系至关重要。氧化应激在各种妊娠生殖疾病的发病机制中起着重要作用。氧化应激损伤时滋养细胞凋亡常与过量的ROS产生[7-9]有关。因此，抑制氧化应激所致的氧化损伤和凋亡是妊娠疾病的重要干预策略。由于H2O2作用于细胞会产生高度活性的自由基，导致细胞氧化，因此H2O2被广泛应用于建立细胞氧化应激模型中[10]。故本研究利用HTR-8/SVneo人胎盘滋养细胞与H2O2共同孵育，以期建立氧化应激损伤模型。

3.1ROS在氧化应激中的作用

ROS作为有氧能量代谢的产物，其生理浓度的维持主要受SOD、CAT、LDH、MDA活性及谷胱甘肽、维生素C和维生素E浓度的影响[11-12]。当这个系统失去平衡时，产生的不完全对立的ROS会导致线粒体功能的改变、蛋白质活性的降低、核酸损伤及诱导凋亡。随后不同的器官系统表现出组织损伤等一系列病理过程[13-15]。近年的研究结果显示，缺乏充分调控的ROS被认为是导致胎盘病理、妊娠紊乱和早产的主要原因[16-21]。本研究结果显示，300、500μmol/L H2O2组明显提高了细胞ROS的水平，其中300μmol/L H2O2作用3h不仅在一定程度上增加了ROS水平(P<0.01)，且保证了细胞的活力；而300μmol/L H2O2在6、12h及500μmol/L H2O2在1、3、6、12h虽明显增加了ROS的水平，但同时造成了细胞的大量死亡。此外，细胞内的抗氧化系统可以对抗氧化应激，其中包括不同的自由基清除抗氧化酶和非酶抗氧化剂。SOD和CAT被认为是最重要的抗活性氧酶。SOD将超氧转化为H2O2，然后CAT将H2O2分解为水和氧气。SOD、CAT等细胞抗氧化酶可降低细胞内ROS含量[22-23]，而脂质过氧化产物可间接反映氧化应激下ROS的生成[24]。MDA作为细胞脂质氧化最重要的产物，可加重细胞膜的损伤，反映细胞膜系统的损伤程度。LDH是一种糖酵解酶，是细胞质膜完整性的指标，存在于机体所有组织细胞的胞质内，在生理状态下不能穿透细胞膜，但当细胞膜发生损伤时，LDH从细胞内漏入细胞外基质[25]，其含量是评价有机抗氧化能力的重要因素。本研究结果表明，经H2O2作用后的实验组，其细胞SOD及CAT水平较对照组均有明显的减少，而LDH、MDA含量较对照组均有明显的提高(均P<0.01)。由此表明，这些细胞抗氧化剂在清除自由基和维持氧化还原平衡方面亦发挥着关键作用。同时，经比较分析各实验组后显示，300μmol/L H2O2组3h既能增加细胞MDA和ROS的生成，降低抗氧化酶活性，同时还出现SOD和CAT含量明显下降，提示H2O2有改变细胞内自由基水平的能力，造成细胞氧化应激损伤，符合细胞氧化应激模型条件的要求。

3.2细胞凋亡参与氧化应激损伤

细胞凋亡是细胞死亡途径的一种程序化和活跃的模式，在正常的生理或病理环境中受自身基因的调控[26]。由于氧化应激损伤和细胞凋亡存在潜在相关性，故观察了H2O2作用后的HTR-8/SVneo细胞是否也具有细胞凋亡增加的现象。本研究结果表明，300μmol/L H2O2作用于人胎盘滋养细胞后，细胞凋亡率相比对照组明显增加，且随着作用时间及浓度的增加，细胞凋亡率明显上升，故表明H2O2对人胎盘滋养细胞有明显的损伤作用(P<0.01)，其参与了细胞凋亡的过程。

综上所述，H2O2可以通过增加细胞ROS和MDA的生成，降低细胞SOD、CAT和LDH水平，抑制抗氧化酶的活性，导致HTR-8/SVneo胎盘滋养细胞发生氧化应激及细胞凋亡。比较H2O2不同作用时间及浓度后，明确300μmol/L H2O2在3h条件下HTR-8/SVneo人胎盘滋养细胞既可以发生明显的氧化应激及细胞凋亡，同时细胞仍具有一定的存活率，故可作为人胎盘滋养细胞氧化应激模型应用于各种妊娠病理疾病的研究中。