膜技术纯化枸杞多糖的试验研究

王博,程国才,王财林,王婷婷,斯聪聪*

膜技术纯化枸杞多糖的试验研究

王博1,程国才2,王财林2,王婷婷3,斯聪聪2*

1. 浙江医药高等专科学校制药工程学院, 浙江 宁波 315100 2. 广东青云山药业有限公司, 广东 韶关 512600 3. 西峡县中等职业学校, 河南 南阳 474550

为精制枸杞多糖（Polysaccharide，LBP），并获得可靠的工艺参数，为工业化生产的实现提供必要的数据积累和依据。本文采用高速离心和膜技术相结合的试验方法对枸杞水提液进行处理，选用截留分子量为1×104的超滤膜浓缩纯化LBP，并用硫酸-苯酚显色法测定截留液和透过液多糖的含量。结果表明:操作时间和操作压力对膜通量有较大的影响。在料液温度25 ℃、操作压力0.8 MPa条件下，对枸杞水提的第一汁、第二汁和合并液超滤4~5 h，所得截留液干燥快速，其多糖含量分别为15.51%、8.36%和14.24%。因此，采用膜技术分离枸杞水提液的工艺操作简单，能耗小，纯化效果较显著，所得成品性状好，适用于工业化生产。

枸杞多糖; 膜技术; 纯化

枸杞是我国传统的名贵中药材，子、花、叶、根、皮都可入药，具有很高的药用和营养价值。枸杞的生物活性成分主要有枸杞多糖（Polysaccharide，LBP）、枸杞色素和枸杞籽油等。枸杞多糖具有调节机体免疫功能、抗氧化、延缓衰老、护肝抗肿瘤、降血脂、防止遗传损伤等作用[1,2]。关于枸杞子的鉴定研究已有很多报道[3]，但枸杞多糖为水溶性物质，生物利用度低，使枸杞多糖被开发成药用剂型最大发挥其疗效带来很大困难[4]。多糖又称多聚糖，是由20个以上的单糖以糖昔键相连组成的聚合物。枸杞多糖的提取主要有水提法、碱提法、酶解法、超声波法和微波法等[5-9]，采用以上方法提取的多糖中常含有无机盐、木质素、醇不溶的小分子有机物（如低聚糖等）及色素等杂质。用于分离枸杞多糖的方法主要有醇沉、柱层析等[2,7,9]。这些方法工序复杂，耗用有机溶剂，生产周期长。其中，传统水提醇沉工艺存在着总固体及有效成分损失严重，乙醇用量大且回收率低，成本高，同时带来防火、防爆安全及环境污染等问题[10]。膜技术以膜两侧的压力差为动力，在常温下使流体中的一种或几种物质能透过，而将其它物质截留，从而实现溶质与溶剂的分离、浓缩与纯化[10,11]。近年来关于膜技术处理枸杞多糖的研究多集中在不同截留分子量的超滤膜对LBP截留率及抗氧化活性的影响方面[12-14]，而有关膜技术在枸杞多糖精制的工业化试验研究鲜有报道。

因此，在膜分离纯化枸杞多糖拟投入大生产的背景下，为了探讨大生产中一边提取一边浓缩纯化枸杞多糖的工艺，本文采用高速离心和膜技术相结合的方法处理枸杞水提取液，从而开展纯化枸杞多糖的试验研究，为膜技术用于枸杞药材深加工和工业化生产积累数据，并提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枸杞子，毫州市建诚药业供应，批号为111001、120480，产地：宁夏，检测数据：水分16.0%，薄层合格，浸63.27%，选用宁夏枸杞子的原因：宁夏地区所产枸杞在枸杞多糖、枸杞黄酮和硒的累积方面具有优势[15]。

无水葡萄糖，标准品；水为纯化水（自制）。

苯酚（C6H6O，PhOH），又名石炭酸、羟基苯，硫酸，两类均为分析纯，源于国药集团化学试剂有限公司。

图 1 膜分离系统试验装置图

1.2 仪器与设备

膜分离设备（见图1），浙江赛特膜技术有限公司生产；超滤膜，膜滤材质为复合膜，膜面积1m2；HH-4数显恒温水浴锅，由国华电器有限公司生产；TQ-0.2型多功能浓缩提取罐，温州正展机械有限公司生产；LNCH-6kg分析天平，称量范围：20~6000 g，检定分度值：1 g，实际分度值：0.1 g，由昆山钰恒电子衡量器有限公司生产；RE-2000A旋转蒸发器，由上海亚荣生化仪器厂生产；DZF-6050型真空干燥箱，由上海一恒科学仪器有限公司生产；GQ145高速管式分离机，分离筒转速14000 r/min，容积11 L，透水能力2 T/h，由上海浦东天本离心机械有限公司生产；UV-6100S紫外可见分光光度计，由上海美谱达仪器有限公司生产。

1.3 试验方法

1.3.1 膜分离纯化工艺流程采用膜技术分离纯化枸杞多糖的工艺流程如图2所示。

图 2 膜分离纯化工艺流程

1.3.2 枸杞提取液制备将枸杞子置于多功能提取罐中，以水为溶媒，加8倍量水回流提取2 h，过滤提取液，得第一汁；对药渣加6倍量水二次回流提取1.5 h，过滤提取液，得第二汁；取第一汁、第二汁各一半，混合得合并液。

1.3.3 枸杞提取液纯化实验采用GQ145高速管式分离机和膜分离设备对枸杞多糖提取液进行两级处理，为了避免对超滤膜造成污染，高速离心（7000 r/min）提取液，通过离心力的作用，使枸杞水提液中一些絮状沉淀、微粒、亚微粒、较大颗粒杂质如药渣等得以沉降分离，固形物沉降效果较好，为超滤提供较好的预处理。

采用超滤膜主要在于去除枸杞药液中分子量较小的无机小分子等。其中，膜孔径是影响膜分离中目标产物收率和含量大小的关键因素。诸多学者[2,9,12]对枸杞多糖分子量及组成的研究表明，其分子量为0.8×104~21.48×104，大多集中在1万以上。因此，选用切割分子量为10000的超滤膜进行试验，并对超滤膜截留液和透过液浓缩、干燥。操作温度和压力对膜分离过程和膜通量有显著的影响。因此，本试验以固收率、枸杞多糖含量和膜通量为性能指标，考察操作时间和操作压力对膜分离纯化过程的影响。其中膜通量计算公式为：膜通量（/(m2·h）=/×，其中为取样（透过液）体积（L），为取样时间点（h），为膜面积（m2）。

1.3.4 枸杞多糖含量的测定采用苯酚~硫酸法测定每份样品中的枸杞多糖含量。

（1）标准曲线的绘制称取10.00 mg无水葡萄糖对照品，加纯化水溶解并定容至100 mL，即得标准溶液100 µg/mL。精密移取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL于20 mL具塞试管中，加水至2.0 mL，后加入5%苯酚溶液1.0 mL，硫酸溶液5.0 mL，摇匀，放置10 min，置沸水浴中加热15 min，取出，冷却至常温[16]。以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度计，在490 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，葡萄糖质量浓度为横坐标，绘制标准曲线[16]。

（2）枸杞提取物中多糖含量的测定精密称取样品40 mg，加入80%乙醇50 mL，加热回流1 h，过滤，滤渣与滤器用热80%乙醇30 mL分次洗涤，滤渣连同滤纸置烧瓶中，加水150 mL，加热回流2 h，过滤，用少量热水洗涤滤器，合并滤液和洗液，放冷、移至250 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL置于具塞试管中，加水1 mL，后加入5%苯酚溶液1.0 mL，硫酸溶液5.0 mL，摇匀，放置10 min，置沸水浴中加热15 min，取出，冷却至常温[16]。以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度计，在490 nm波长处测定吸光度，根据标准曲线得出的回归方程[16]，计算供试品溶液中的多糖含量（µg），计算公式如下：

式中：，样品中多糖含量（以葡萄糖计）（g/100 mL）；，供试品溶液中含葡萄糖的质量（mg）；，样品稀释倍数；1，比色时所取的样品溶液体积（mL）。

2 结果与分析

2.1 试验现象观察

观察膜浓缩枸杞第二汁时流量计中的截留液和透过液颜色，发现截留液随着时间的推移逐渐变深变浓。取截留液和透过液各500 mL浓缩后，先后置于恒温水浴锅和真空干燥箱干燥。结果发现，截留液可干燥，透过液为膏状，易吸潮，不易干燥。主要是因为枸杞水提液中醇不溶的小分子有机物如低聚糖透过超滤膜而存在于透过液中。

2.2 试验数据及分析

对第一汁、第二汁和合并液各进行两次膜分离纯化试验。对其截留液和透过液浓缩、干燥后检测枸杞多糖含量，计算部分含固量、固收、相对收率和绝对收率，取平均值，见表1。

表 1 膜浓缩枸杞试验结果

由表1可知：（1）膜浓缩枸杞第二汁水提液，料液含固量由2.39%增加到3.78%，提高了58.16%；第一汁枸杞水提液，料液含固量由3.38%增加到4.27%，提高了26.33%。表明对含固量较低的料液进行超滤，含固量会有较大幅度的提升空间；（2）枸杞果肉中多糖含量为4.35%，经过超滤膜分离后，第一汁、第二汁和合并液的截留液多糖含量可达15.51%、8.36%和14.24%，第一汁多糖含量为第二汁的1.8倍，膜分离效果好。只是截留液的收率仅有7.29%，有待提高。透过液多糖含量为3.7%，表明切割分子量为1万的超滤膜可以截留大部分枸杞多糖，多糖损失较少；（3）膜技术纯化枸杞多糖获得的工艺参数，可为工业化生产提供一定的数据支持。

2.3 操作时间-膜通量关系图

采用截留分子量为1×104超滤膜，在操作压力为0.8 MPa、溶液温度为常温（25 ℃）时进行超滤试验，测得膜通量随时间而变化的关系，见图3。

由图3可以看出：

（1）膜通量在开始的0.5 h内下降明显，随后，膜通量的衰减变化比较缓慢，在料液浓缩到一定程度时，膜通量降低到较小值，并基本恒定。原因是采用了高速离心预处理，去除了大量的大分子物质，减轻了浓差极化和凝胶层阻挡作用，因而使膜处理过程相对稳定。

（2）膜浓缩第一汁0.67 h时，膜通量降至6 L/(m2·h)，3 h后趋于平稳状态。膜浓缩枸杞第二汁时，在前1.25 h内，膜通量达到10 L/(m2·h)以上，2.75 h后才降至6 L/(m2·h)。

（3）4 h内浓缩33 L第一汁和45 L第二汁的膜通量分别为2.76~8.16 L/(m2·h)和5.22~25.2 L/(m2·h)。同样条件下，第二汁的膜通量高于第一汁，且膜设备对第二汁的处理量也更大。结合表1可知，料液含固量越高，膜分离耗时越多，故料液浓度较高时，可补水稀释进一步分离，提高纯度。

图 3 操作时间对膜通量的影响

2.4 操作压力对膜通量的影响

料液温度为25 ℃时进行超滤（1 W）试验，测得膜通量随压力变化的关系，见图4。

由图4可见：试验过程中，料液的膜通量随着操作压力的增大而增大；但随着料液浓度的增大，尤其是后期，增大压力后，膜通量是下降的。原因是料液含固量过高，超滤膜和料液之间的浓差极化急剧增加，使膜面上较快形成凝胶层，从而增大了料液透过膜的阻力，所以，即使增大压力，也难以挽回膜通量下降的趋势。

图 4 操作压力对膜通量的影响

2.5 操作时间对压力、温度的影响

起始压力为0.8 MPa、料液温度为18.5 ℃时，在自然状态下对枸杞水提液进行超滤（1 W）试验，记录数据，并绘制时间-压力、时间-温度曲线，见图5。

由图5可知，料液含固量随着时间逐渐增大，温度缓慢提高，且膜通量呈下降趋势。从整体趋势上看，随着料液浓度的增大，尤其是后期，压力会缓慢上升。

图 5 操作时间对料液温度、操作压力的影响

3 结论

膜分离技术属于物理方法，不会引入杂质，且在低温下可实现药液的分离纯化，耗能少，操作条件温和，减少了药材有效成分的影响。枸杞水提液第一汁和合并液经过超滤处理后，其截留液干燥快速，且多糖含量>14%，与枸杞药材中LBP含量相比，提高了3倍以上。膜分离效果好，产品纯度较高，生产效率高，具有重要的使用价值。经过多次的试验研究，工艺技术参数趋于稳定，因此，利用切割分子量为1万的超滤膜分离纯化枸杞多糖方法可行，工艺操作简单，能耗小，产品可靠，中试完成后，容易实现工业化、规模化生产。

本研究获得的工艺参数，为生产中第二汁的提取和第一汁的浓缩纯化同时进行提供了一定的数据积累和支持，并为生产上枸杞的提取、分离、浓缩、纯化一体化工程技术实施的可行性提供了参考依据，对枸杞纯化的工业化生产具有一定的工程指导意义。

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Experimental Study on Purification of Polysaccharides inby Membrane Technology

WANG Bo1, CHENG Guo-cai2, WANG Cai-lin2, WANG Ting-ting3, SI Cong-cong2*

1.315100,2.512600,3.474500,

TOextract Polysaccharides fromand get reliable operation parameters which could provide an essential basis and dataaccumulation for the industrial-scale production, Combining with the high speed centrifugation method, ultrafiltration membrane was carried out to separate and purifypolysaccharides (LBP). The molecular weight cut-off of LBP was 1×104.Sulphuric acid-phenol method was used to determine the content of polysaccharides from the trapped fluid and permeation fluid in experimental process.Results showed that the pressure, time and temperature had great influences on the flux. While the operating pressure was 0.8 MPa, the solution temperature was 25 ℃ and the time was 4~5 hours, the content of LBP from the different rapped fluid of first juice extract, second juice extract and mixed extract were 15.51%, 8.36% and 14.24% respectively. And the trapped fluid could be quickly dried. The membrane separation technology forwater extract with low energy consuming was simple and purification efficiency was fairly significant. The finished products had good character, suitable for industrial production.

Polysaccharides (LBP); membrane technlogy; purification

R284.2

A

1000-2324(2019)03-0420-05

10.3969/j.issn.1000-2324.2019.03.013

2018-04-05

2018-05-18

浙江省教育厅高等学校访问工程师校企合作项目(FW2012005);校级课题(2019011)

王博(1984-),女,硕士,讲师,主要从事制药设备、膜技术等相关工作. E-mail:green1224@163.com

Author for correspondence. E-mail:sicongcong@taiyi-nb.com