稳斑汤对ApoE基因敲除小鼠AS不稳定斑块凋亡相关基因Caspase-3表达的影响*

于长生 宫丽鸿 肖福龙

（辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032）

动脉粥样硬化是引起心脑血管病的重要病理基础，主要表为血管壁出现粥样物质，导致血管腔不同程度狭窄，最终引起血管堵塞，出现供血障碍。近年来动脉粥样硬化的发病率及致死率逐年上升［1］。动脉粥样硬化的发病机制可以从不同角度进行阐述［2］。研究表明动脉粥样硬化的独立危险因素之一是凋亡［3］，斑块内细胞的凋亡不利于斑块稳定。细胞凋亡参与了动脉粥样硬化的发病过程。Caspases属于半胱氨酸蛋白酶， 其对于凋亡有重要的促进作用［4］。 前期研究［5-7］证明搜风祛痰中药复方稳斑汤具有抗动脉粥样硬化及稳定斑块作用，因此本文在前期基础上从凋亡角度观察稳斑汤对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化不稳定斑块凋亡相关基因Caspase-3表达的影响，以便于探讨稳斑汤抗动脉粥样硬化的作用机制，丰富稳斑汤的临床应用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验动物6～8周ApoE基因敲除小鼠70只，正常 C57BL/6J小鼠12只，由北京大学实验动物中心美国Jackson实验室成功引进并培育，实验动物合格证号：SCXK （京）2013-0001。SPF级，体质量（19.0±1.0）g，雌雄各半。用含1.5%胆固醇的高脂饲料（经60Coγ灭菌照射处理，辽宁中医药大学动物实验室提供）饲养ApoE基因敲除小鼠，正常小鼠给普通饲料喂养，饲养条件为2级，室温保持在22～24℃，相对湿度 50%，光照时间 7∶00～19∶00，自由饮食水。

1.2 试药与仪器 1）试药。稳斑汤组方：地龙15 g，全蝎 5 g，水蛭 15 g，蜈蚣 1 条，陈皮 15 g，白术 15 g，半夏15 g。将上述中药加工，并制成含生药2 g/mL的中药浓缩液，由辽宁中医药大学附属医院中药局生产；阿托伐他汀钙片10 mg/片（辉瑞制药有限公司，批准文号J20030047）。苏木精染液、伊红染液（北京博奥森生物科技有限公司）；两步法RT-PCR试剂盒（购自北京全式金生物技术有限公司，批号AT401-D1）；DNA maker（购自北京全式金生物技术有限公司，批号BM121-01）；Trizol（购自 invitrogen 公司，批号 15596-026）；引物（北京三博远志生物技术有限公司代为合成）。2）仪器：300型脱水机，EG1150型石蜡包埋机，RM2235型切片机均为德国Leica公司产品；BX41型数码显微镜，CHA型光学显微镜均为Olympus公司产品。

1.3 模型制备 13周后，随机处死4只，取腹主动脉根部，HE染色观察动脉粥样硬化程度，确定模型制造成功。

1.4 分组与给药 造模成功的ApoE基因敲除小鼠66只，随机选取60只分为模型组，稳斑汤低、中、高剂量组及他汀组，每组12只。继续予高脂饲料喂养，根据成人每日临床推荐的常用剂量，按成人与小鼠的体表面积折算系数0.0026折算成小鼠用量。模型组给予生理盐水0.3 mL/d，稳斑汤低、中、高剂量组分别给予稳斑汤 6.175、12.35、24.7 g/（kg·d），他汀组给予阿托伐他汀 27.3 mg/（kg·d）。 各组每日灌胃给药 1次。 正常C57BL/6J小鼠12只设为空白对照组，给予普通饲料喂养，生理盐水0.3 mL/d灌胃。各组均给药7 d。

1.5 标本采集与检测 末次给药当日夜晚禁食，第2天取材。每组分别随机选取10只小鼠，禁食并经眼眶静脉丛取血，将血清离心，并冻存于-80℃。脱颈处死小鼠，解剖并取心脏及主动脉，利用10%甲醛固定心脏，冻存管内保存主动脉。1）主动脉组织病理学观察：于主动脉根部取出4个相同切面，0.9%氯化钠溶液冲洗，固定，乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，6 μm厚度进行切片。继而进行苏木精-伊红染色，树胶封片。光镜下观察其组织形态。2）Caspase-3 mRNA检测：采用RT-PCR法检测各组小鼠动脉组织中Caspase-3 mRNA的表达。Trizol抽提法提取动脉组织中总RNA，测定浓度及质量后，采用一步法RT-PCR试剂盒，以β-actin为内参，对Caspase-3相应引物进行扩增（引物序列：上游引物：5′-CTGGACTGCGGTATTG AG-3′， 下游引物：5′-GGGTGCGGTAGAGTAAGC-3′，102 bp）。PCR 反应体系：cDNA 3 μL，10 mmol/LdNTP 2.5 μL，25 mmol/L Mg2+5 μL，10×PCR Buffer 5μL，DEPC H2O 31 μL，Taq 酶 0.5 μL，Caspase-3、β-action 引物各 1.5 μL。 94℃变性 1 min，58℃退火 1 min，72℃延伸1.5 min，循环35次。扩增产物与1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像分析系统中采集图像，并测定目的基因和内参基因扩增条带的积分光密度值，并以目的基因积分光密度值/内参基因积分光密度值的比值作为该例样本目的基因的相对表达水平，进行统计分析。

1.6 统计学处理 应用SPSS18.0统计软件。计量资料以（±s）表示。组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠主动脉形态学改变的比较 见图1。空白组：小鼠主动脉内膜表面光滑未见异常。模型组：动脉管壁破损，并有明显的粥样硬化斑块出现，斑块内可见大量泡沫细胞，偶有一些炎性细胞。稳斑汤组、他汀组：主动脉内膜均有不同程度的斑块，但其面积均小于模型组。

图1 各组小鼠腹主动脉病理情况（HE染色，100倍）

2.2 各组小鼠主动脉组织中Caspase-3的mRNA表达水平的比较 见表1、图2。与空白对照组比较，模型组Caspase-3 mRNA含量升高（P＜0.05）。与模型组比较，稳斑汤中、高剂量组Caspase-3 mRNA含量均降低（P＜0.05）。与他汀组比较，稳斑汤中、高剂量组Caspase-3 mRNA含量无明显差异（P＞0.05）。

3 讨 论

古代中医并没有动脉粥样硬化病名，根据临床表现可将其归属于胸痹心痛等疾病。患者多食膏粱厚味，以致脾伤虚而生痰，痰瘀互结以致内痈毒热生风。风邪特点为善行而数变，风痰内动，相似于动脉粥样硬化斑块的破裂。正如《医方考》言“风痰者，湿土生痰，痰生热，热生风也”，故宫丽鸿教授创新性提出风痰理论并创以稳斑汤治疗此病，方药中蜈蚣具有息风、止痉、通络功效；全蝎具有息风、通络、散结功效；地龙具有息风、平喘、通络功效，3药合用共为君药。而白术、陈皮、半夏具有宽胸理气、燥湿化痰作用，为臣药；水蛭具有破血逐瘀、通经作用，用为佐药，上述7味药物发挥搜风祛痰、祛瘀通络作用。

表1 各组小鼠主动脉组织中Caspase-3mRNA表达水平（±s）

表1 各组小鼠主动脉组织中Caspase-3mRNA表达水平（±s）

与模型组比较，*P＜0.05；与空白对照组比较，△P＜0.05

组 别 n空白对照组 10模型组 10他汀组 10 Caspase-3 mRNA 0.194±0.023 0.497±0.029△0.266±0.043*稳斑汤低剂量组 10 0.448±0.114△稳斑汤中剂量组 10 0.324±0.042*△稳斑汤高剂量组 10 0.257±0.038*

图2 各组主动脉组织Caspase-3 mRNA表达电泳图

动脉粥样硬化严重影响人类健康和生活质量，其危险因素包括高龄、高血糖、同型半胱氨酸、吸烟等。不稳定斑块的破裂可致严重心血管事件发生，威胁患者生存［8］。动脉内膜有不稳定斑块形成是动脉粥样硬化的特征性表现。动脉粥样硬化的病理生理机制多种多样［9-10］，目前研究认为与脂质损伤、炎症损害、氧化损伤、免疫功能障碍等因素相关。

细胞凋亡属于细胞程序性死亡［11］，并且是细胞主动死亡。细胞凋亡的特征主要是细胞膨胀继而出现皱缩，染色质凝聚成新月状，细胞膜内陷，进而导致细胞破裂，凋亡小体形成，被巨噬细胞消化［12］。很多刺激均可诱导细胞发生凋亡。细胞受到刺激作用，产生正向的细胞信号，通过线粒体启动细胞凋亡［13］。心血管疾病的发病过程中由细胞凋亡的参与，如动脉粥样硬化。因此，减少细胞凋亡的发生对于治疗和预防AS具有至关重要作用。细胞凋亡的诱导通路主要包括死亡受体通路和细胞应激途径，Caspase-3的激活与他们密切相关［14］，因此Caspase-3被认为是细胞凋亡的关键酶，线粒体在此中具有关键作用［15］。研究表明线粒体的损伤与心血管疾病的发生密切相关［16］。线粒体受到损伤后释放CytC到胞质，激活Caspase-3，进而被分为两部分从而诱导凋亡［17］。有研究发现上调Bcl-2的表达，调节Caspase活性，减少CytC的释放，从而抑制oxLDL导致的巨噬细胞凋亡［18］。吴限等［19］研究结果表明心脑通络液能降低Caspase-3的表达，上调Bcl-2的表达，从而延缓动脉粥样硬化的进展起到抗动脉粥样硬化的作用。 徐欣华等［20］研究表明 Caspase-3、MMP2 表达水平与斑块的不稳定具有相关性。

阿托伐他汀钙片属于他汀类药物，是人工合成的3-羟基-3-甲基-辅酶A还原酶的竞争性抑制剂［21］，具有稳定斑块，改善血管内皮功能、抗炎、抗氧化应激作用以及抑制血栓的形成等作用，因此阿托伐他汀钙片是临床常用的调节血脂，稳定动脉硬化斑块，预防动脉粥样硬化的首选药物［22］。故本实验选择阿托伐他汀钙片作为西药对照药。

本研究采用高脂饲料饲养ApoE基因敲除小鼠成功建立动脉粥样硬化模型，其主要表现为形态学改变，管腔内可见显著的粥样硬化斑块出现，斑块内可有大量泡沫细胞形成等。与模型组比较，稳斑汤各剂量组的小鼠相关血管病变程度轻、管腔面积增加，说明具有搜风祛痰功能的稳斑汤具有抗动脉粥样硬化形成的作用。

本研究显示，与空白对照组比较，模型组Caspase-3 mRNA表达水平升高，表明动脉粥样硬化发生时，可引起Caspase-3 mRNA表达水平的升高，而稳斑汤中、高剂量组与他汀组均能不同程度地降低Caspase-3 mRNA表达水平，这说明抑制凋亡相关基因Caspase-3表达，可以有效抑制动脉粥样硬化，稳定动脉粥样硬化不稳定斑块。与他汀组比较，稳斑汤中、高剂量组的Caspase-3 mRNA表达无明显差异，说明稳斑汤中、高剂量组同阿托伐他汀片在抑制凋亡方面作用相当。综上所述，稳斑汤可能通过下调ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化不稳定斑块凋亡相关基因Caspase-3的表达来干预动脉粥样硬化不稳定斑块的形成及破裂。