温下健脾法对脓毒症胃肠功能障碍大鼠肠道菌群及肠道免疫的影响*

刘 锦 郭 楠 徐亚文 刘福生

（1.北京中医药大学东直门医院，北京中医药大学脓毒症研究所，北京 100700；2.北京中医药大学，北京 100029；3.北京中医药大学东方医院，北京 100078）

脓毒症（sepsis）是指由感染引起的宿主反应失调导致的器官功能障碍；多器官功能障碍脓毒症死亡的重要原因［1］。不仅在发达国家，还是在老龄化的发展中国家均是严重的公共卫生问题［2］。在我国面临全面人口老龄化的国情背景下，脓毒症的情况更为突出。胃肠功能障碍在脓毒症患者非常普遍，对脓毒症患者的预后具有重要意义［3］。西医治疗脓毒症胃肠功能障碍的基本方法为抑制胃酸、尽早肠内营养、补充肠道益生菌、促进胃肠动力、补充微量元素等，临床疗效有待进一步提高［4］。脓毒症胃肠功能障碍属于中医脾胃功能的范畴，病机为本虚标实证，扶正与祛邪并举的治疗方案有助于降低脓毒症患者的病死率［5-6］。中医药防治脓毒症胃肠功能障碍具有一定的优势［7］。攻下法是在治疗脓毒症胃肠功能障碍中发挥了重要作用；同时应强调顾护脾胃，不可一味攻伐，避免损伤脾胃［8］。临床观察及研究表明温下法可以降低脓毒症患者的死亡率［9］。基于脓毒症胃肠功能障碍大鼠模型，本研究观察温下健脾法治疗脓毒症胃肠功能障碍的疗效，进一步探讨温下健脾法对脓毒症胃肠功能障碍肠道菌群及肠道免疫的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康SPF级雄性SD大鼠，体质量200～230 g，购买于北京维通利华实验动物科技有限公司［许可证号SCXK（京）2016-0006］，饲养于北京中医药大学东方医院实验动物中心屏障动物饲养室 ［许可证号SYXK（京）2014-0008］，按屏障环境内动物实验观察与操作规范进行实验。

1.2 试药与仪器 1）试药：大黄附子汤加味由生大黄9 g，炮附子 15 g，细辛 3 g，生黄芪 20 g，党参 20 g，姜黄9 g，炙甘草10 g组成，购自北京康仁堂药业有限公司并提供质量控制检测。2）仪器：离心机，微量移液器及酶标仪（Thermo Scientific，USA），显微镜（OLYMPUS U-CMAD-2），图像采集系统（Nikon DS-Fi2）；sIgA 试剂盒 （Lifespan，USA，LSF28068），D-乳酸检测试剂盒（BlueGene，E09D0015）；移液器吸头（10 μL 及 200 μL），解剖剪，缝合线，液氮，超低温冰箱，碘酒，甲醛溶液，冻存管及采血管，乳胶手套，滤纸购自北京百诺威生物科技有限公司。

1.3 造模及分组 采用盲肠结扎穿孔法（CLP）复制大鼠脓毒症模型，造模方法及模型判定方法同前［10］。对造模成功的24只大鼠随机分为模型对照组和中药组各12只，并以10只大鼠行假手术（麻醉后仅对大鼠行开腹手术，找到盲肠，但未行结扎或穿孔。）作为正常对照组。

1.4 干预方法 造模成功后各组大鼠均禁食不禁水饲养。中药组大鼠术前及术后24 h给予大黄附子汤加味中药（4 mg/g，2次/24 h）灌胃，模型对照组和中药组予等量灭菌注射用水灌胃。给药24 h后4%水合氯醛麻醉后取材。

1.5 取材方法 麻醉前强迫大鼠排便至冻存管中，快速将粪便保存-80℃以待测定；麻醉后腹主动脉取全血，离心后分装-80℃以待测定；分离肠系膜，剪取上端至幽门，下端至回盲部的肠管；剪取距盲肠根部小肠2 cm，剪开肠管，取粪便保存-80℃以待测定；使用生理盐水冲洗干净肠内容物后放入冻存管-80℃以待测定。

1.6 观察指标 1）大鼠肠道菌群的测定：取大鼠降结肠及直肠粪便，利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司）。根据16S rDNA的测序结果，使用的UPARSE软件version 7.1，根据97%的相似度对序列进行OTU聚类；使用UCHIME软件剔除嵌合体。利用RDP classifier对每条序列进行物种分类注释。16S rDNA测序分析数据采用I-Sanger云平台完成了数据分析。2）大鼠肠道黏膜分泌型免疫球蛋白（sIgA）及血清D-乳酸的表达水平测定：大鼠肠道黏膜sIgA检测通过肠道组织裂解、蛋白抽提，釆用ELLISA试剂盒测定，按照试剂盒说明的各项步骤进行检测。血清D-乳酸的表达水平采用ELISA方法，根据试剂盒说明的各项步骤进行检测。

1.7 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件。计量资料以（±s）表示，正态分布数据组间对比采用One Way ANOVA检验；计数资料采用率或百分比表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠生存率比较 见表1。正常对照组大鼠无死亡；造模成功治疗24 h后模型组大鼠死亡率低于模型组（P＜0.05），提示温下健脾法可以降低CLP脓毒大鼠的死亡率。

表1 各组大鼠生存率比较（n）

2.2 各组大鼠肠道菌群比较 组间肠道菌群的对比采用16S rDNA测序分析得到了766个OUT，13个门，21个纲，30个目，52个科，141个属，282个种。拟杆菌纲（Bacteroidetes）生活在人或者动物的肠道中，种类很多，属于条件致病菌。在肠道菌群物种丰度方面，Bacteroidetes表达水平在模型对照组 （24.36±7.15）＜正常对照组（45.20±6.05）＜中药组（49.69±7.98）（P＜0.05，见图1A-B，表2）。变形菌门（Proteobacteria）包括很多病原菌（如大肠杆菌、沙门氏菌等）。Proteobacteria表达量在模型对照组和中药组明显高于正常对照组，提示Proteobacteria可能是CLP脓毒症大鼠的特征致病菌；中药组Proteobacteria表达量低于模型对照组 （见图1A-B），进一步采用PCoA分析，结果提示正常对照组和中药组差异小于正常对照组与模型对照组的差异（见图1C），以上结果表明温下健脾法温下健脾法调整CLP脓毒大鼠肠道菌群的紊乱。

图1 不同组间大鼠肠道菌群的差异

表2 各组主要肠道菌群组成比较（%，±s）

表2 各组主要肠道菌群组成比较（%，±s）

组 别 n Proteobacteria Firmicutes Bacteroidetes正常对照组 10 4.09±2.14模型对照组 12 10.03±7.55 52.91±5.36 45.20±6.05 54.26±26.94 24.36±7.15▲中药组 12 5.72±4.16 43.61±9.23 49.69±7.98△▲

2.3 各组大鼠肠黏膜sIgA及血清D-乳酸比较 见表3。CLP模型组大鼠肠黏膜sIgA的表达水平低于中药组及正常对照组（P＜0.05），中药组大鼠肠黏膜sIgA的表达水平稍低于正常对照组，组间无统计学差异（P＞0.05）。血清D-乳酸的水平在正常对照组＜中药组＜模型组（P＜0.05）。结果表明温下健脾法可以提高CLP脓毒症大鼠肠道黏膜sIgA的表达水平，降低血清D-乳酸的水平。

表3 各组肠道黏膜sIgA及血清D-乳酸的比较（μg/mL，±s）

组 别 n 肠道黏膜sIgA 血清D-乳酸正常对照组 10模型对照组 12 26.27±2.05 7.90±0.69 11.57±0.31▲ 12.16±0.75▲中药组 12 21.25±7.41△ 9.20±0.56△▲

3 讨 论

脓毒症炎症介质大量释放导致毛细血管渗漏及血管舒缩障碍都会累及胃肠功能及正常肠道黏膜屏障。正常黏膜功能受损引起肠道细菌移位及内毒素入血，从而加重脓毒症的进展［11］。胃肠功能紊乱已成为判断MODS患者预后的一个重要条件［12-13］。西医治疗脓毒症胃肠功能障碍优势在于提供肠道营养、抑制胃酸及补充益生菌、微量元素等。脓毒症胃肠功能障碍属脾胃范畴，脾胃主运化功能与肠道屏障及肠道菌群密切相关，二者在消化吸收、生长发育、抗御外邪等方面起重要作用。中医药治疗脓毒症胃肠功能障碍的优势在于调整机体及胃肠功能。脓毒症胃肠功能障碍患者往往存在正气不足，若单纯使用辅助正气容易助邪、单用祛邪容易伤及正气［8］。

大黄附子汤加减为代表的温下法治疗危重症胃肠功能障碍切中病机［14］，能改善脓毒症患者炎症状态和胃肠功能障碍、降低死亡率［15］。本研究从免疫屏障及生物屏障的角度研究温下健脾法调节脓毒症导致的肠道屏障损伤。本研究以CLP诱导脓毒症大鼠为载体，该动物模型具有脓毒症胃肠功能障碍的特点。在温下剂的代表方大黄附子汤的基础上增加党参、生黄芪等健脾药物，观察温下健脾法治疗脓毒症胃肠功能障碍的疗效及对肠道微菌群及肠道黏膜免疫的影响。大黄附子汤出自《金匮要略》，由大黄、附子、细辛3味药物组成，既有大黄通里攻下以祛邪，又有附子、细辛温里散寒以扶正。大黄清热通腑、活血解毒，附子温阳祛寒，大黄藉附子之大热，其寒性去而走泻之性存，是治疗脓毒症胃肠功能障碍的有效中药［16］；细辛辛散温通、宣通阳气；党参、生黄芪益气健脾。正常肠道黏膜屏障由机械屏障、化学屏障、免疫屏障与生物屏障共同构成。本研究侧重于评价温下健脾法对脓毒症生物屏障及免疫屏障的影响。肠道微生态平衡和人体健康息息相关，可以与肠道相关淋巴组织产生的特异性sIgA进入肠道能选择性阻碍革兰氏阴性菌与上皮细胞受体相结合，同时刺激肠道黏液分泌并加速黏液层的流动，可有效地阻止细菌对肠黏膜的黏附，形成免疫屏障。D-乳酸主要来源于胃肠道细菌的酵解，在重症感染患者早期即升高，可以反映肠道通透性且可预测感染性休克的发生，感染、缺血和创伤性休克引起肠道功能障碍均能导致血中D-乳酸浓度的升高［17］。本研究综合病死率、肠道菌群、肠道黏膜免疫、D-乳酸作为评价温下健脾法治疗脓毒症的疗效和机制指标。

本研究结果表明温下健脾法可以调整脓毒症引起的肠道Bacteroidetes的降低和Proteobacteria的升高；改善肠道黏膜免疫，降低肠道通透性；从而降低脓毒症大鼠的死亡率。这与大黄附子汤可减轻失血性休克复苏后肠道黏膜屏障损伤的报道相一致［18］。本研究是在大黄附子汤加味对脓毒症胃肠功能障碍的小肠运动、肠道机械屏障［10］的基础上，结合健脾类中药有助于调节肠道菌群紊乱［19］,进一步探讨温下健脾法对脓毒症胃肠功能障碍肠道免疫屏障及生物屏障的作用。本研究的创新在于采用温下法联合健脾法治疗脓毒症胃肠功能障碍，肠道菌群的对比采用16S rDNA测序分析，明确了温下健脾法可以调节肠道菌群，但温下健脾法调节脓毒症胃肠功能障碍肠道菌群的具体机制有待进一步研究。

综上所述，温下健脾法可以降低脓毒症胃肠功能障碍的死亡率，调节脓毒症引起的菌群紊乱和肠道免疫异常，改善肠黏膜通透性，从而发挥治疗脓毒症的作用。