珠子参总皂苷对心肌缺血再灌注大鼠血清MCP-1、MIF和TNF-α的影响

张 磊，许 强，李盈盈，刘宏军

心肌缺血再灌注损伤(MIRI)是指心肌缺血一定时间后，再次恢复心肌血供反而会加重心肌损伤。急性心肌梗死病人在接受最佳的再灌注治疗后，仍有10%～30%会发生MIRI，MIRI被认为是导致心肌梗死后心力衰竭、死亡的主要原因[1]，因此，如何防治MIRI显得尤为重要。有研究表明，炎症因子水平的高低与缺血后心脏功能损害程度和心肌细胞凋亡数量直接相关，提示炎症反应在MIRI中起着重要作用[2-3]。单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)是一种趋化因子，在心肌MIRI时表达增加，可引发一系列炎症反应，并与巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等共同参与炎症的发生发展，在MIRI中发挥着重要作用[4]。在关于如何减轻MIRI程度的研究中，采用中药有效成分提取物或中药复方进行预处理，显示出一定的优势[3]。珠子参是五加科人参属植物珠子参的干燥根状茎，具有补肺养阴、祛瘀止痛、止血之功，珠子参总皂苷是其主要活血成分之一[5]。有研究表明，珠子参总皂苷对心脑血管疾病有着广泛的药理作用[5]。本研究旨在探讨珠子参总皂苷对大鼠MIRI保护作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠40只，体质量252～306 g，由三峡大学实验动物中心提供[许可证号：SCXK(鄂)2011-0012]。参照国家实验动物饲养和使用指南，室温(22±2)℃，湿度(60±5)%，12 h明暗循环，自由饮食和饮水。

1.2 药物与试剂 珠子参总皂苷，由三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室提供，纯度为96.5%；MCP-1(南京建成科技有限公司)；MIF(南京建成科技有限公司)；大鼠TNF-α(南京建成科技有限公司)；20%氨基甲酸乙酯溶液(湖北信康医药化工有限公司)。

1.3 主要仪器 电子天平(上海天平仪器厂)；LDZ5-2 型自动平衡离心机(北京医用离心机厂)； ALC-V8 型动物呼吸机(上海奥尔特生物科技有限公司)；16导生理信号采集分析系统(美国 Biopac 公司)。

1.4 分组与给药 采用随机数字表法将大鼠分为5组：假手术组、模型组和珠子参总皂苷低剂量组(50 mg/kg)、中剂量组(100 mg/kg)、高剂量组(200 mg/kg)。珠子参总皂苷组灌胃给予相应的药物，灌胃体积为20 mL/kg，每天给药1次，连续给药1周，假手术组和模型组给予同体积的生理盐水。

1.5 模型建立 大鼠MIRI模型的制备参考文献[6]，具体如下：术前禁食12 h，末次给药30 min后，采用20%氨基甲酸乙酯溶液(1.5 g/kg)行腹腔麻醉后，将大鼠仰卧固定于手术台上。经口腔行气管插管，连接小动物呼吸机，呼吸频率80次/min，潮气量5～6 mL，呼吸比1∶2。针形电极插入四肢皮下，连接心电图机，记录Ⅱ导联心电图。在胸骨左侧第4肋间，沿肋间隙方向剪开1 cm左右的切口，钝性分离肌肉组织，用弯头钳打开胸腔，挤压心脏，使其充分暴露。在左心耳和肺动脉圆锥间找到与左冠状动脉伴行的冠状静脉，在左心耳下方2 mm处以6/0无损伤缝合针穿线，进针深度为1.0～1.5 mm，宽度为2～3 mm。结扎前，于冠状静脉处放置棉线，连同棉线(1.5～2.0 mm)一起结扎冠状动脉前降支，造成心肌缺血。30 min后再次开胸，剪断结扎线，使其再灌注120 min。假手术组只在相应部位穿线不结扎。模型复制成功的标准：结扎冠状动脉后其远端心肌颜色变灰白，Ⅱ导联心电图ST段明显抬高，表示心肌缺血复制成功；剪断结扎线后，心肌颜色由灰白逐渐恢复正常，抬高的ST段下降1/2以上为再灌注复制成功。

1.6 标本采集与监测 再灌注结束后，腹主动脉取血5 mL，静置30 min后以3 000 r/min离心15 min，取血清，采用ELISA方法测定各组大鼠血清MCP-1、MIF和TNF-α。

2 结 果

2.1 大鼠在体MIRI模型评估 本研究共拟建立大鼠在体MIRI模型40只。在实际操作过程中，仅珠子参总皂苷中剂量组1只大鼠发生气胸死亡，其余大鼠全部建模成功。

2.2 珠子参总皂苷对MIRI大鼠血清MCP-1、MIF和TNF-α的影响 与假手术组比较，模型组大鼠血清 MCP-1、MIF、TNF-α水平明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)； 与模型组比较，珠子参总皂苷高、中、低剂量组血清MCP-1、MIF、TNF-α水平均下降，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表 1。

表1 各组大鼠血清MCP-1、MIF、TNF-α水平比较(±s)

与假手术组比较，1)P<0.01；与模型组比较，2)P<0.05

3 讨 论

目前关于MIRI的机制研究有很多，炎症反应被认为是MIRI的主要机制之一[7]。MIRI是一个复杂的病理生理过程，炎症在其中扮演着重要角色。研究表明，炎症细胞在再灌注早期即可侵入心肌组织，损伤心肌局部释放大量的蛋白水解酶及促炎症因子，进而诱导和加重心肌损伤[8-9]。

MCP-1是趋化因子家族成员之一，主要由内皮细胞、巨噬细胞、血管平滑肌细胞和单核细胞产生，能够趋化、激活单核-巨噬细胞迁移并聚集在血管内膜下，最终能够活化为巨噬细胞，吞噬类脂质，形成富含胆固醇酯的泡沫细胞，从而导致动脉粥样硬化(AS)的发生[10]。MCP-1与冠心病关系密切，甚至可将其作为预测急性冠脉综合征(ACS)的一个指标[11]。心肌缺血再灌注时，MCP-1表达增加，趋化和激活单核-巨噬细胞、T淋巴细胞和自然杀伤细胞等免疫细胞,引起一系列炎症反应，从而加重心肌损伤[12]。CC类趋化因子受体2(CCR2)是MCP-1的特异性受体，可以介导单核细胞聚集并迁移浸润到血管壁内，促进AS的形成。Hayasaki等[13]将小鼠CCR2基因敲除后，其缺血再灌注心肌炎性细胞浸润显著降低，心肌梗死面积缩小。MIF是一种新型炎症因子，主要由单核细胞核内皮细胞分泌，具有多种独特的性能和效能，可刺激巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶(MMPs)，在AS及不稳定斑块的发展中发挥了重要作用。此外，MIF还可诱导MCP-1的表达并经由MCP-1的作用机制使巨噬细胞发生聚集，直接或间接地刺激巨噬细胞分泌一些细胞因子，产生炎症放大效应[14]。TNF-α是体内重要的炎症因子，由巨噬细胞产生，可通过自分泌方式作用于其他巨噬细胞，引起更多巨噬细胞的活化，从而放大炎症反应。MCP-1、MIF与TNF-α相互之间的作用，构成一个复杂的炎症反应系统，在启动和促进心肌细胞的再灌注损伤过程中发挥了重要作用。

珠子参对改善缺血性损伤具有广泛的药理作用[5]。既往研究表明，珠子参总皂苷对心肌缺血性损伤具有较好的保护作用，其作用机制可能与抗氧化损伤有关[15]。通过本实验发现，模型组大鼠血清MCP-1、MIF、TNF-α浓度显著升高，珠子参总皂苷干预组大鼠血清 MCP-1、MIF与TNF-α的水平都明显下降，提示珠子参总皂苷对MIRI大鼠心肌的保护作用机制可能与其抑制MCP-1、MIF和TNF-α的表达有关。