外源ABA对番茄花粉成熟的细胞学影响

李 静，季淑婷，陈林凤，解思瑾，庄新研，冷 平，戴圣杰*

脱落酸（Abscisic acid，ABA）因能促使叶子脱落而得名，曾被普遍认为是一种抑制生长的植物激素。其广泛分布于高等植物，除促使叶子脱落外还被证明有很多其他重要的调控作用，如促进芽及种子进入休眠状态、引起气孔关闭、增加抗逆性等。近年来，随着研究的深入，人们对ABA的功能了解越来越多。ABA不再是一种促进脱落、促进衰老的“消极”激素，而是参与生长发育的“积极”激素。如，研究发现ABA参与雌、雄花的分化以及调节种子胚的发育（Chandra and Sawhney，1991；Finkelstein et al.，2002；肖华山等，2003；Cheng et al.，2014）。最近的研究发现，ABA广泛参与到果实的发育成熟过程中（Sun et al.，2012；Zhang et al.，2018），并且在糖信号和同化物的分配中也发挥着重要的作用（Villalobos-Gonzálezet al.，2016；Jia et al.，2017；Oh et al.，2017）。然而，ABA是否在花粉成熟中发挥作用，其相关的机理研究报道不多。

ABA是赤霉素（Gibberellic Acid，GA）-诱导形态响应的一种有效抑制剂，已知ABA和GA3之间严格的平衡调控多种植物的发育过程（Zeevaart and Creelman，1988；Zeevaart，1983）。ABA也能影响体外培养的番茄花器官的发育（Rastogi，1988）。Chandra Sekhar（1991）指出，对番茄的幼嫩花芽外施ABA影响雄蕊和雌蕊的发育。肖华山等（2003）表示荔枝雄花中雄蕊的发育与ABA有直接关系，ABA浓度低时有利于雄蕊发育，高浓度的ABA有利于雌蕊的发育。近年来，人们对水蕨（Ceratopteris richardii）中雄性植株向雌雄同体植株的转变展开了广泛的研究，普遍认为ABA在雄性植株向雌雄同体植株的转变中起到关键的作用（Warne et al.，1991；Ganger et al.，2015）。最近Mcadam等（2016）在水蕨中的研究显示，ABA调控生殖周期中雄性植株在雌雄同体中的性别比例。由此推断，ABA很可能在性别决定中起到重要的调控作用，但其中的分子机制尚不清晰。

为探究ABA在雄蕊发育中的具体作用，本文采用不同浓度的ABA溶液以及不同浓度的ABA生物合成抑制剂NDGA（Nordihydroguaiaretic acid，即去甲二氢愈创木酸）溶液分别处理番茄雄蕊，以确定能有效引起花粉败育的最佳ABA及NDGA溶度。研究结果将为进一步阐明ABA调控植物雄蕊发育的机理提供理论基础，同时也为ABA相关的雄性不育在育种工作中的研究应用提供实践基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本试验材料为番茄澳粉208自交系（Solanum lycopersicum cv Aofen 208），植株种植在临沂大学校内标准温室中，温度条件为白天温度25±5℃，夜间温度18±5℃。在其花器官的发育过程中，根据雄性配子的发育特点、花蕾的长度、形态及其解剖学结构将花器官分为9个发育期：时期Ⅰ（花蕾长度4mm，造孢细胞时期）、时期Ⅱ（花蕾长度6mm，小孢子母细胞时期）、时期Ⅲ（花蕾长度8mm，四分体时期）、时期Ⅳ（花蕾长度10mm，小孢子时期）、Ⅴ（花蕾长度15mm，初级花粉粒时期）、Ⅵ（萼片松动露出花瓣，花粉成熟中）、Ⅶ（花瓣松动，花粉成熟）、Ⅷ（盛开前1天）、Ⅸ（盛开）。

1.2 试验方法

选取小孢子时期的花蕾，用不同浓度的ABA（0，10，100，1000M）溶液和NDGA（0，10，100，1000M）溶液进行处理。用1ml注射器吸取药液用针头轻轻掰开萼片，将药液注入花药处，分别在处理之后的第2天、4天、6天及8天取样。以上操作皆进行3次生物学重复。

将每次所取花蕾立即放入FAA固定液（无水乙醇50ml，冰醋酸5ml，福尔马林10ml，去离子水35ml，再加入甘油5ml）中，真空抽气20～30min，固定24h后进行石蜡切片制作。经FAA固定液固定的样品，经叔丁醇梯度脱水之后，包埋在石蜡中。在轮转切片机上进行切片（切片厚度为8～10μm），然后将切片放在干净的载玻片上，加去离子水浮片，之后放在43℃的烘箱中进行烘片。烘片24h后，在二甲苯中去蜡，然后经梯度乙醇复水后，在海氏苏木精染液中染色。再经梯度乙醇脱水后，经1%固绿复染，经二甲苯透明之后用加拿大树胶封片观察。

在显微镜下观察来统计正常花粉的百分率。经苏木精和固绿染色后，在显微镜下观察花粉，会很清楚的观察到有的花粉空瘪、透明、畸形，为异常的花粉，有的花粉饱满、规则、不透光，为正常花粉。以此统计正常花粉的百分率可初步判断花粉的质量。正常花粉的百分率越高，花粉质量相对越高。在显微镜下用测微尺观察测定各品种花粉粒的形状（不规则、规则的圆形）、饱满度。每个样品随机观测3个视野。

在OLYMPUS BX41光学显微镜下观察，并用OLYMPUS C-7070 Wide Zoom拍照，照片用Adobe Photoshop CS5软件进行编辑处理。

图1 番茄花器官发育期

2 结果与分析

2.1 不同浓度NDGA溶液对番茄花药的处理

前期研究发现，ABA生物合成关键酶基因被抑制的转基因番茄中其花粉的异常从四分体时期之后开始（Dai et al.，2018），因此，我们选择第Ⅳ时期（图1，白色箭头），此时花粉的发育处于小孢子细胞时期，分别用0、10、100及1000μM的NDGA溶液处理花药，之后分别在处理后的第2、4、6、8天取样观察。利用显微切片技术，我们观察到对照组在处理的第2、4、6、8天后发育良好，随着花药的成熟，小孢子细胞进一步发育完全，形状逐渐发育成规则的圆形，染色亦均匀浓厚（图2，A1-A4）；在第8天已经有75%以上的花粉粒发育成熟（图2，A4和图4，A）。然而，不同浓度的NDGA溶液处理花药之后，不同程度地引起了花粉成熟的异常。10μM的NDGA溶液处理花药，在第2天时发现少量畸形花粉，而在第4天出现大量的畸形花粉粒，在第6天，畸形花粉粒的数目逐渐增加，到了处理后的第8天畸形花粉粒的比率达到了90%（图2，B1-B4和图4，A）。100μM的NDGA溶液处理花药，在第4天就出现显著的畸形花粉，正常的花粉率只在12%左右（图4，A），之后随着处理时间的延长，正常花粉率维持在10%左右（图2，C1-C4和图4，A）。而1 000μM的NDGA溶液在处理后的第2天就表现出显著的异常（图2，D1），正常花粉率下降至10%左右（图4，A），随着处理时间的延长，正常花粉率维持在10%左右（图2，D1-D4和图4，A）。

图2 NDGA处理番茄花药的显微观察

以上结果表明，用不同浓度的ABA生物合成抑制剂NDGA处理番茄花药会不同程度的影响花粉的成熟，NDGA的浓度越高、处理时间越长对花粉成熟的影响越严重。

2.2 不同浓度ABA溶液对番茄花药的处理

对于ABA的处理，对照组随着发育的正常进行其正常花粉的百分率逐渐升高，到第8天达到80%（图3，A1-A4和图4，B）。用10μM的ABA溶液处理花药，在第2天出现少量异常花粉（图3，B1），随着处理时间的延长正常花粉的百分率逐渐下降，到处理后的第8天正常花粉的百分率仅维持在10%左右（图3，B1-B4和图4，B）。100μM和1 000μM的ABA溶液处理有着相似的趋势，在处理后的第2天皆开始出现少量异常的花粉，而在处理后的第4天开始出现大量异常花粉，并且正常花粉的百分率已降低到10%左右，此后随着处理时间的延长维持在10%左右（图3，C1-C4，D1-D4和图4，B）。

图3 ABA处理番茄花药的显微观察

图4 不同处理条件下正常花粉的百分率

结果表明，过多的ABA亦会导致花粉成熟异常，且不同浓度的ABA溶液处理花药表现出相似的结果。

3 讨论

番茄（Solanum lycopersicum）为雌雄同花植物，通常由雌雄性配子的结合进行繁殖。雄蕊的正常发育对于番茄繁衍、种质资源存续，尤其产量有决定性影响。然而，雄性不育的发现、研究和利用有效推动了多种农作物杂交种的应用和推广。雄性不育在作物育种中具有重要发展潜力和应用价值。番茄雄性不育分为花粉败育型、雄蕊退化型及功能不育型。目前番茄雄性不育基因虽然已定位到各条染色体，但尚需进一步精细定位（Omidvar，2017）。影响番茄雄性不育的因素繁多，如激素（何长征等，2002；Fellner et al.，2001）、环境（Bergougnoux et al.，2012）、物质代谢和能量代谢（Goetz et al.，2001）等。目前，番茄雄性不育的调控研究主要为生理生化水平方面，其分子机制研究不多，特别是脱落酸对雄性不育影响的分子机理尚不清楚。

ABA是调控植物生长、休眠等生理过程及响应逆境的重要植物激素。为研究ABA对植物生长发育的影响，人们分别用不同浓度的ABA溶液处理植物的各种组织和器官，并且在不同的物种中所采用的浓度各异（Sun et al.，2013；Jia et al.，2017）。因此，为探究ABA对花药发育的影响，本文采用了0、10、100和1 000μM四个梯度的ABA溶液以摸索出适合于番茄花药处理的有效ABA浓度。

在ABA生物合成抑制剂NDGA处理部分，用不同浓度的NDGA处理番茄花药会不同程度的影响花粉的成熟，NDGA的浓度越高、处理时间越长对花粉成熟的影响越严重（畸形花粉出现的越早、越多）。这说明ABA在番茄花粉的成熟中可能起到至关重要的作用，并且用浓度超过10μM的NDGA溶液处理番茄花粉就能有效的引起番茄花粉不育。

而ABA的处理发现，过多的ABA亦会导致花粉成熟异常，不同浓度的ABA溶液处理花药表现出相似的结果。本文中所用到的10、100和1 000μM的ABA溶液在处理后的第2天皆出现大量畸形花粉粒，此后随着处理时间的延长影响程度加剧，但总体保持相似的趋势。这说明，在番茄花粉的成熟过程中并非ABA浓度越高越好，当超过某一阈值时就会对番茄花粉的发育起到抑制的作用。而本文中10μM的ABA溶液也远远超过了花粉发育所需的阈值，对花粉发育所需ABA阈值的摸索有待后期进一步研究，而采用超过阈值浓度的ABA处理花药即可有效地引起花粉败育。

本研究结果将为进一步阐明ABA调控植物雄蕊发育的分子机制、揭示雄性不育的调控机理，同时也为ABA相关的雄性不育在育种工作中的应用提供一定的理论基础。