Let-7家族启动子区多态性与胃癌的关联研究

张 麒，艾 良

(云南省肿瘤医院腹部外科，云南昆明 650118)

微小RNA(miRNA)来源于基因组DNA，经过多步加工，由初始体miRNA发展到前体miRNA，再发展到成熟体miRNA。虽然不编码蛋白质，但是可与靶基因3′-非翻译区结合发挥重要的调控功能。Let-7，最早发现的miRNA之一，包括10个家族成员，多以簇的形式存在，参与肿瘤的演变[1-2]。胃癌组织中，let-7多个家族成员低表达，具有类似于抑癌基因的作用，例如let-7a、let-7f和let-7i等[1,3-4]。最近，有研究报道，位于let-7家族成员启动子区的2个多核苷酸多态性(SNP)rs10877887和rs13293512不同等位基因可能与转录因子的亲和力不同，引起let-7的异常表达和个体对肿瘤的易感性不同，包括肝癌[5-7]、甲状腺乳头状癌[8]、肺癌[9]和宫颈癌[10]。本研究探讨rs10877887和rs13293512与中国汉族人群胃癌的相关性，旨在筛选胃癌新的易感基因,为胃癌的精准治疗提供理论依据。

(4)道德素质。道德素质既是客服人员服务客户的底限，也是提升客服工作水平的必要要素，道德素质主要包括个体道德、职业道德、社会公共道德。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取本院腹部外科住院的经组织病理学证实为胃癌的172例患者作为病例组，另选取同期到本院参加临床试验的健康者224例作为对照组。胃癌诊断采用美国癌症联合研究会2010(第七版)分期标准。病例组和对照组纳入标准：同意参加本次研究并愿意提供血液样本者。病例组排除标准：有肿瘤家族史、胃癌复发或其他部位原发癌转移至胃者。对照组排除标准：有肿瘤家族史和急慢性胃炎者。本研究经医院伦理委员会批准，所有入选对象均签署知情同意书。所有病例和对照临床资料通过查阅医院病历资料获得，查阅资料包括：性别、年龄、民族、家族史、居住地、肿瘤临床特征(分期、分化程度和淋巴结转移状态)。病例组中，男117例，女55例，平均(58.7±12.5)岁；临床Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期患者分别为82例和90例；高中分化和低分化癌分别为124例和48例；有无淋巴结转移各67例和105例。所有患者均未经放化疗和抗癌药物治疗。对照组中，男157例，女67例，平均(57.7±9.9)岁。两组受试者来源于云南汉族人群，在性别、年龄、种族和居住地等方面匹配，彼此之间无血缘关系。

1.2样本采集和DNA提取 采集入选研究对象空腹外周静脉血2～3 mL，乙二胺四乙酸二钠抗凝，-20 ℃保存备用。按照全血基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技公司，北京)操作说明提取基因组DNA，运用NanoDrop分光光度计检测DNA纯度和浓度。DNA纯度在1.7～1.9并且浓度大于20 ng/μL的样本符合要求，不符合要求者，重新提取DNA。

1.3Let-7启动子区rs10877887和rs13293512多态性检测 采用TaqMan对rs10877887和rs13293512进行分型。根据文献[6]合成引物和探针，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列为：rs10877887上游：5′-CCC ATT TCC TGC TTT CGA G-3′，下游：5′-GCG TTC TGT ACG TCA GCC AC-3′; rs13293512上游：5′-GCA GGG AAG ACA GTG AAT GTT AAA-3′，下游：5′-CCA AGA AAG CAG TAT TAT CAA TGA AGT T-3′。探针序列为： rs10877887探针：FAM-CGG CTC TCC CCG CAG GAC-TAMRA,HEX-AGC GGC TCT CTC CGC AGG AC-TAMRA。rs13293512探针：FAM-CTG GTT GAG TTT TGC T-MGB,HEX-CTG GTT GAG TTT CGC TT-MGB。反应体系(10 μL)如下：基因组DNA 20 ng，2×反应混合物5.0 μL，引物和探针各0.25 μL，无菌去离子水补足10 μL。扩增产物经测序验证正确后进行定量PCR反应。ABI 7500 Fast实时荧光定量PCR仪上设定如下扩增程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，45个循环。反应结束后，分析记录数据，统计分析结果。双盲法判读结果如下：rs10877887CC和rs13293512TT为蓝色荧光；rs10877887TT和rs13293512CC为绿色荧光；rs10877887CT和rs13293512CT均为青色荧光。SNP分型结果经Sanger测序验证，2种方法结果完全一致。

MiRNA虽然不编码蛋白，但是作为重要的调节因子调控靶基因表达参与多种疾病的病理生理学过程；不仅与肿瘤发生、发展和侵袭转移密切相关，而且有望作为肿瘤诊断、治疗和预后判断新的标记物[11-13]。以往研究显示，miRNA启动子区遗传变异可影响其表达进而影响肿瘤的易感性[14-16]。Let-7作为最早发现的一个miRNA，在肿瘤中的抑癌作用已经得到证实，然而，并非所有let-7低表达的个体肿瘤的风险均较低，提示不同个体存在遗传差异。2011年，黄芳等[6]报道了位于let-7启动子区的2个功能性多态位点rs10877887和rs13293512：前者位于let-7i上游-286 bp处，后者位于let-7a-1/let-7f-1/let-7d基因簇上游-8 496 bp处。2个多态性位点不同等位基因与转录因子骨髓锌脂1和干扰素调节因子1的亲和力不同，可能影响let-7的表达并影响个体对肿瘤的易感性差异[5-6]。关于这2个功能性SNPs与胃癌风险的研究鲜有报道。本研究调查了rs10877887和rs13293512与胃癌的相关性，发现rs10877887 CC基因型和C等位基因增加了胃癌的发病风险，调整OR值分别为1.98和1.46。

2.2rs10877887和rs13293512多态性与胃癌发病风险的关系 rs10877887和rs13293512多态性测序图见图1、2。两位点多态性与胃癌发病风险的关系见表2。rs10877887 CC基因型携带者胃癌的发病风险较TT基因型携带者增加了1.98倍(95%CI：1.11～3.54，P=0.02)；在显性遗传模型中，CT/CC基因型携带者胃癌的发病风险较TT基因型携带者增加了1.53倍(95%CI：1.02～2.29，P=0.04)。rs10877887 C等位基因携带者胃癌的发病风险较T等位基因携带者增加了1.46倍(95%CI：1.09～1.95，P=0.01)。

2 结 果

2.1Hardy-Weinberg遗传平衡吻合度检验 Hardy-Weinberg遗传平衡吻合度检验见表1。rs10877887位点：病例组和对照组观察值和期望值吻合度较好，χ2值分别为2.47和2.89，P值分别为0.12和0.09；rs13293512位点：病例组和对照组观察值和期望值吻合度良好，χ2值分别为0.80和0.08，P值分别为0.37和0.77，表明两位点均符合Hardy-Weinberg平衡定律，具有群体代表性。

表1 病例组和对照组rs10877887和rs13293512

近年来，对Weitzenböck,Finsler-Hadwiger不等式的研究精彩纷呈，文[4]也总结了一系列研究成果，其中有：

图1 rs10877887多态性测序图

图2 rs13293512多态性测序图

多态性对照组[n(%)]病例组[n(%)]调整OR(95%CI)调整P值rs10877887 TT105(46.9)63(36.6)Reference CT89(39.7)73(42.4)1.37(0.88～2.12)0.16 CC30(13.4)36(20.9)1.98(1.11～3.54)0.02显性模型 TT105(46.9)63(36.6)Reference CT/CC119(53.1)109(63.4)1.53(1.02～2.29)0.04隐性模型 TT/CT194(86.6)136(79.1)Reference CC30(13.4)36(20.9)1.71(1.00～2.91)0.05等位基因 T 299(66.7)199(57.8)Reference C149(33.3)145(42.2)1.46(1.09～1.95)0.01rs13293512 TT80(35.7)59(34.3)Reference CT113(50.5)85(49.4)1.02(0.65～1.58)0.94 CC31(13.8)28(16.3)1.20(0.65～2.22)0.57显性模型 TT80(35.7)59(34.3)Reference CT/CC144(64.3)113(65.7)1.06(0.70～1.61)0.78隐性模型 TT/CT193(86.2)144(83.7)Reference CC31(13.8)28(16.3)1.21(0.69～2.10)0.51等位基因 T273(60.9)203(59.0)Reference C 175(39.1)141(41.0)1.08(0.81～1.44)0.60

3 讨 论

最后，在现行管理中，教学督导、教师教育教学的奖励和违规处理、学生评教等方式方法各自独立行事，没有一个有机的结合，而教师本身是独立完整的，教师的教育教学工作也是一个综合的情况，不能由某一个单一的方面来确定。

本研究结果与肝癌、肺癌和宫颈癌中观察到的结果一致。携带rs10877887 C等位基因的肝癌患者较T等位基因携带者生存期明显缩短，相对风险1.22[5-6]。rs10877887 CT/CC基因型携带者较TT基因型携带者肺癌的风险增加了103.2%，尤其60岁以上的人群，风险增加了585.7%[9]。rs10877887 CC基因型携带者宫颈鳞状细胞癌的风险增加了111%，并且let-7i表达量明显降低[10]。与本研究结果不同的是，rs10877887 CT基因型携带者在杂合子、显性遗传模型和超显性遗传模型对比中均降低了甲状腺乳头状癌的风险，相对风险度分别为0.73、0.79和0.73；亚组分析显示rs10877887 CC基因型携带者更易出现多发性甲状腺乳头状癌；rs13293512 CT/CC或者CC基因型携带者更不易发生淋巴结转移[8]。许桂平等[17]运用meta分析评价了rs10877887与癌症的相关性，纳入肝癌、头颈癌、口腔癌和甲状腺癌，发现CT/CC基因型降低了癌症的风险。导致以上结果不一致的可能原因是：(1)肿瘤类型不同，易感基因不同；(2)基因-基因和基因-环境交互作用的影响。

研究证实，胃癌中let-7多个家族成员(包括let-7a、7f和7i等)呈低表达，靶向丙酮酸激酶M2型(PKM2)和肌球蛋白重链9(MYH9)抑制胃癌细胞增殖、侵袭和迁移[1,3-4]。PKM2的过表达与胃癌淋巴结转移、临床分期和不良预后有关，通过介导PI3K/AKT活化促进细胞迁移并抑制自噬，导致胃癌的恶性演变[18-19]。MYH9通过环状RNA-miRNA-mRNA的相互作用参与胃癌的发生、发展，沉默MYH9的表达可使胃癌细胞早期凋亡增加，细胞周期受阻于G2/M期[20-21]。由于rs10877887和rs13293512不同等位基因与转录因子骨髓锌脂1和干扰素调节因子1的结合力不同，引起let-7的异常表达和个体对多种肿瘤的易感性不同[5-6]，由此认为let-7启动子SNP-let-7表达PKM2/MYH9轴可能是胃癌发病的一条重要途径。基于以上背景，本研究观察到的rs10877887增加胃癌风险的可能机制是：位于let-7i启动子区的rs10877887C等位基因降低了具有抑癌作用的let-7i的表达量，对PKM2和/或MYH9的抑制作用减弱，致使胃癌的患病风险增加。准确机制有待进一步研究。

4 结 论

本研究发现let-7i启动子区的rs10877887CC基因型增加了中国汉族人群胃癌的发病风险，提示其为胃癌的易感基因之一。深入开展分子机制研究有助于全面了解rs10877887在胃癌中的作用。