蛇床子酸缓冲温敏型凝胶的制备与体外评价*

李金玲，王亚静，石惠姝，王亚楠，商利娜，赵海宁，张 怡，周梦楠

（天津中医药大学，现代中药发现与制剂技术教育部工程研究中心，天津 301617）

老年性阴道炎是一种由于绝经后卵巢功能衰退、雌激素水平降低引发的妇女常见且多发的疾病，在绝经妇女中的发生率为26.1%～30.0%[1]，患者患处发炎、瘙痒、疼痛，严重影响生活质量。健康女性阴道呈适度弱酸性，而老年绝经妇女由于体内雌激素水平降低阴道上皮细胞内糖元减少，阴道内pH值增高，使酸性乳酸杆菌不再成为优势菌，局部抵抗力降低，为致病菌提供了有利的生存环境[2-4]，菌群平衡失调最终导致致病菌感染，因此恢复和维持阴道酸性微环境，对重建阴道正常的微生物平衡起到重要作用。

中药蛇床子具有杀虫止痒、消炎镇痛等药理作用[5]，可减缓老年性阴道炎患者症状，现代药理研究表明蛇床子中蛇床子素等主要成分还具有雌激素样作用[6]，显示出在老年性阴道炎防治中良好的应用前景。由于阴道的特殊生理结构和特点，不仅给药不便且药物往往难以抵达阴道深部、易于漏出、局部作用时间较短。温敏凝胶作为一种环境敏感型智能凝胶，在贮存温度下呈液态，注入体内响应给药部位体温变化发生相变，转化成非化学交联的半固体凝胶，不仅克服传统阴道制剂铺展性差、覆盖率低的缺点，还具有延长药物局部滞留时间、增加生物利用度[7]、减少给药次数的应用潜力。本文以蛇床子提取物为模型药物，制备具有酸缓冲功能的温敏型中药凝胶，并对其从胶凝温度、胶凝时间、铺展性、黏度、体外释放等方面进行系统评价，为老年性阴道炎外用制剂的设计与开发提供参考。

1 材料与仪器

蛇床子提取浓缩液（自制，70%乙醇提取，浓缩至2 g生药/mL）；泊洛沙姆 188（WPAK539B巴斯夫），泊洛沙姆 407（WPAK596B巴斯夫），甘油（1024C0314北京索莱宝），尼泊金乙酯（20180507安徽山河药用辅料股份有限公司），PEG400（20180301北京鼎国生物技术有限责任公司），乳酸（H41022972北京索莱宝），乳酸钠（20180428北京索莱宝），纯化水（milip设备制备），甲醇（天津市康科德科技有限公司，色谱纯），乙腈（天津市康科德科技有限公司，色谱纯）；高效液相色谱仪（日本Shinadzu公司，SPD-20A紫外检测器；LC-20T泵LCSolution色谱工作站），YP1001N电子天平（上海菁海仪器有限公司），PB-10 pH 测定仪（Sartorius），DK-98-II电热恒温水浴锅（天津市泰斯仪器有限公司），全自动智能溶出仪（德国ERWEKA公司），干式恒温器（杭州奥盛有限公司），DV-III型黏度计（美国Brookfield公司）

2 方法与结果

2.1 凝胶的制备 采用冷溶法制备温敏凝胶[8]。量取纯化水，加入2 g蛇床子提取浓缩液，在磁力搅拌下依次加入2 g PEG400，0.04 g尼泊金乙酯及处方量的酸缓冲溶液和温敏基质，补加纯化水至20 g，搅匀后于4℃冰箱中冷藏24 h，直至聚合物完全溶胀后即得。

2.2 评价指标

2.2.1 胶凝温度 将液体温敏凝胶置于0℃环境中，保证待测样品拥有相同初始条件，取液体状态的待测样品，置于25℃干式恒温器上预热5 min后，以0.5℃/min的速率升温至40℃，每升高0.5℃，观察液体流动情况，容器倒转凝胶不流动时的温度即为胶凝温度，平行测定3次，取均值。

2.2.2 铺展性 参照文献[9]分别测量胶凝前后的凝胶直径，平行测定3次，取均值。

2.2.3 胶凝时间 将表面皿水浴加热至37℃。取0.5 mL温敏凝胶溶液于表面皿上方3 cm处进行推注，记录溶液停止流动的时间，平行测定3次，取均值。

2.2.4 pH值及缓冲能力 采用pH计平行测定3次，取均值。以3 mL，1.4%NaHCO3溶液（pH为7.5）模拟老年性阴道炎患者阴道pH状况[10]，缓冲能力以加入阴道模拟液后的pH值改变量来表示。

2.2.5 黏度测定 参照《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2015年版四部旋转黏度计测定法[5]采用DV-III型黏度计，64号转子，转速45 r/min，测量温度为37℃，平行测定3次，取均值。

2.2.6 体外药物释放 色谱条件：色谱柱为ZORAX Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-水（65∶35），体积流量 1.0 mL/min，检测波长322 nm，柱温30℃，进样量10 μL。参照《中国药典》2015年版四部第二法桨法[5]测定溶出度。精密称取蛇床子温敏型凝胶1.0 g于透析袋中，以200 mL乳酸-乳酸钠缓冲系统（pH=4）作为溶出介质，在（37±0.5）℃，转速100 r/min条件下进行试验，分别在0.5、4、12、30、36 h 取样，用 0.22 μm 的微孔滤膜过滤，同时补充同温新鲜介质，样品按以上色谱条件测定峰面积，并计算累积释放百分率。

2.3 酸缓冲体系的考察

2.3.1 缓冲能力的考察 称取乳酸9.0 g，乳酸钠18.8 g，加水至100 g，制得pH值为4的乳酸-乳酸钠缓冲溶液，分别取 0.1、0.3、0.6、0.9、1.0、1.2、1.3、1.4 g，加水至20.0 g，分别加入3 mL阴道模拟液，按2.2.4项下方法测定其缓冲能力，结果见表1。由表可知，缓冲溶液用量在1.0～1.4 g时，其缓冲能力均能满足维持pH值小于4.5。

表1 酸缓冲体系对缓冲能力的影响

2.3.2 对胶凝温度的影响 分别取pH值为4的乳酸-乳酸钠缓冲溶液 1.0、1.1、1.2、1.3、1.4 g，按 2.1 项下方法制备泊洛沙姆407质量浓度为17%，泊洛沙姆188质量浓度为6%的温敏凝胶，按2.2.1项下方法测定胶凝温度，结果见图1。由表可知，乳酸-乳酸钠缓冲溶液的加入对温敏凝胶的胶凝温度有明显的影响，且随着乳酸-乳酸钠缓冲溶液用量的增加，胶凝温度呈现降低趋势。

图1 酸缓冲体系对胶凝温度的影响

2.4 处方优化

2.4.1 D-最优混料实验 以胶凝温度为指标，采用Design-Expert 8.0.6软件进行最优混料设计，前期实验已确定处方载药量为5%，保湿剂PEG400为10%，防腐剂尼泊金乙酯为0.2%。因此，泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、缓冲溶液用量及纯化水用量共占处方实际比例84.8%，根据预实验结果设定其混料优选范围为：泊洛沙姆 407（A）：14.0%～17.0%、泊洛沙姆 188（B）：0%～16.0%、酸缓冲体系（C）：5.0%～7.0%和纯化水（D）：44.8%～65.8%。按2.1项下方法制备温敏凝胶，按2.2.1项下方法测定胶凝温度，结果见表2。

表2 混料设计实验结果表

2.4.2 模型拟合分析 采用Design-Expert 8.0.6软件，对各自变量和因变量的关系进行模型拟合，以拟合方程的拟合优度（R2）和置信度（P）作为模型判定标准，结果见表3，表中3次多项式拟合模型R2值最大，P值较低，模型拟合方程为Y=-4173.17X1+244.50X2+36.49X3+39.00X4+30 357.69X1X2+3 048.17X1X3+4 081.19X1X4-91.31X2X3-310.24X2X4-51.15X3X4-22 490.52X1X2X3-21 690.38X1X2X4+2574.64X1X3X4-119.40X2X3X4+59380.21X1X2（X1-X2）。根据最佳模型拟合方程，确定最优处方为5.0%蛇床子提取物、0.2%尼泊金乙酯、10.0%PEG400、16.4%泊洛沙姆407、5.2%泊洛沙姆188、5.6%酸缓冲体系、57.6%纯化水。

表3 指标的回归分析

2.5 体外评价

2.5.1 凝胶特性评价 以最优处方制备3批样品，按2.2项下方法进行评价，结果见表4。

表4 蛇床子酸缓冲温敏凝胶的质量评价

2.5.2 体外药物释放结果 按2.2.6项下方法测定温敏凝胶在不同时间的累计释放百分率，分别以零级方程，一级方程及Higuchi方程3种释药模型对蛇床子酸缓冲温敏凝胶进行拟合，得到符合该曲线的方程，并用相关系数r判断其拟合程度，以r最大为优，结果见表5。由表可知，蛇床子酸缓冲温敏凝胶的体外释放符合一级动力学模型，表明蛇床子酸缓冲温敏凝胶具有良好的缓释效果。

表5 蛇床子阴道酸缓冲温敏凝胶体外释放模型拟合结果

3 讨论

健康女性阴道内乳酸杆菌可将阴道内剥落的上皮细胞中的糖元转化为乳酸，使阴道pH值维持在3.5～4.5的正常范围内，而老年性阴道炎患者由于病变阴道内pH值上升至7.5[11]，从而造成阴道微环境的改变，使得阴道优势菌种乳酸杆菌逐渐减少，阴道菌群失调，局部抵抗力下降，为广泛分布的体内外条件致病菌提供了入侵和大量繁殖的环境。本文以缓冲能力及胶凝温度为指标对中药蛇床子温敏凝胶乳酸-乳酸钠缓冲体系进行考察，确定了既满足维持pH值小于4.5，又保持凝胶胶凝温度在35℃的缓冲体系用量，该酸缓冲体系的建立有助于恢复和维持患者阴道酸性微环境，为阴道内优势菌群提供良好的生存环境，进而重建阴道正常的微生物平衡，增加阴道抗病防御能力，对老年性阴道炎的防治具有积极作用。

本文以胶凝温度作为考察指标，采用D-最优混料设计对处方优化并确定中药蛇床子酸缓冲温敏凝胶处方。所制得的凝胶在室温下（25℃）呈液体状态，黏度为（113.7±5.7）mPa/s，铺展性良好，可保证药物注入体内时与阴道褶皱充分接触。在阴道温度下转化为胶凝状态，胶凝时间为（2.4±0.4）s，黏度为（444.3±29.3）×104mPa/s，胶凝迅速、黏度增大可有效延长药物局部滞留时间，提高药物疗效，此外体外药物释放符合一级动力学模型，表明该凝胶具有良好的缓释作用，符合老年性阴道炎局部用药的生理结构特点及用药需求，为老年性阴道炎外用制剂的设计与开发提供参考。