独活标准汤剂UPLC特征图谱的研究和分析

闫晓鑫 ，张志强 ，杜守颖

（1.北京康仁堂药业有限公司，北京 101300；2.北京中医药大学，北京 100029）

独活为伞形科植物重齿毛当归（Angelica pubescens Maxim.f.biserrata Shan et Yuan）的干燥根，属祛风除湿类中草药[1]。具有祛风除湿，通痹止痛之功效。可用于风寒湿痹，腰膝疼痛，少阴伏风头痛，风寒挟湿头痛[2-3]。其主要化学成分为蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯等为主的香豆素类及挥发油类成分。但是中药为多类成分的共存体，内部种类众多，变化复杂，单一的成分用于中药质量评价已经无法满足实际需要[4]。

中药饮片标准汤剂是以中医药理论为指导，临床应用为基础，经标准化工艺制备而成的单味中药饮片水煎液[5-6]。该理论被提出之后，便成为了中药现代工艺转化的标尺，也为不同来源、形式的中药，提供了参照物，以保证所得产品的质量。

本研究从独活的道地及主产区收集了18批独活，用于建立其标准汤剂的特征图谱，使用高效液相色谱-质谱联用（LC-MS）对特征图谱中不同成分进行分析指认，使用SPSS软件对特征图谱进行主成分分析（PCA）和聚类分析（HCA）评价，并对煎煮过程的转移概率进行量化，研究煎煮过程的内在成分变化，阐释煎煮对于独活内在成分的影响规律，以建立独活标准汤剂超高效液相色谱（UPLC）特征图谱，为完善独活配方颗粒的特征图谱质量控制奠定基础。

1 实验材料

1.1 仪器 岛津LC-30AD超高效液相色谱仪，LC-30AD四元泵，SIL-30AC自动进样器，SPD-20A紫外检测器，CTO-20A柱温箱（日本岛津株式会社），Labsolution DB工作站；Waters ACQUITY UPLC®HClass超高效液相色谱仪；PDA Detector检测器；TUV Detector检测器；Empower 3色谱工作站；岛津LC-20A高效液相色谱仪，LC-20A四元泵，SIL-20AC自动进样器，SPD-20A紫外检测器，CTO-10A柱温箱（日本岛津株式会社）；JY20002电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；BSA124S电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；ME104E电子天平[梅特勒·托利多仪器（上海）有限公司]；XP-26电子天平[梅特勒·托利多仪器（上海）有限公司]；ET18电位滴定仪[梅特勒·托利多仪器（上海）有限公司]；KQ-500DB超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DZKW-4电子恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）；DHG-9140A电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 试药与试剂 蛇床子素对照品（批号：110822-201609，纯度99.6%），二氢欧山芹醇当归酸酯对照品（批号：111583-201304，纯度98.3%）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇（Fisher Chemical）、乙腈（默克）、甲酸（Fisher Scientific）为色谱纯；水为蒸馏水；甲醇为分析纯。

1.3 药材

1.3.1 独活药材 独活药材共18批，见表1。

1.3.2 独活饮片 按照《中华人民共和国药典》2015年版独活项下方法“除去杂质，洗净，润透，切薄片，低温干燥”制备，见表1。

表1 独活药材信息表

2 方法

2.1 独活标准汤剂的制备 以卫生部、国家中医药管理局发布的《医疗机构中药煎药室管理规范》和国家药典委员会发布的《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》为依据[7]，考察独活标准汤剂工艺条件，以制备“独活标准汤剂”。

取独活饮片100 g，置于砂锅中，一煎加入饮片量9倍水，浸泡30 min，武火煮沸后，文火煎煮30min，趁热过滤，迅速冷却，备用；二煎加饮片量7倍水，武火煮沸后，文火煎煮20 min，趁热150目纱布过滤，迅速冷却备用；合并滤液，减压浓缩（≤50℃），浓缩至料液比约为1∶1，冷冻干燥，即得。

2.2 独活配方颗粒特征图谱的建立

2.2.1 参照物溶液的制备 分别取蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含蛇床子素20 μg、含二氢欧山芹醇当归酸酯2 μg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品0.2 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，称定质量，超声处理20 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Extend C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；以甲醇为流动相A，水为流动相B，按表2中的规定进行梯度洗脱，检测波长为330 nm，柱温35℃，流速0.3 mL/min，进样量：5 μL。理论塔板数按二氢欧山芹醇当归酸酯峰计算应不低于10 000[8-10]。

表2 梯度洗脱表

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 精密度考察 取独活标准汤剂冻干粉（批号：180209-445800-18）按2.2.3项下方法测定，连续检测6次，获得其特征图谱，以8号峰（蛇床子素）为参照峰，计算其相对峰面积和相对保留时间，并计算RSD。各特征峰的相对保留时间RSD在0%～0.9%范围内，相对峰面积的RSD在0%～3.8%范围内，表明该特征图谱的精密度较好。

2.2.4.2 重复性考察 取独活标准汤剂冻干粉（批号：180209-445800-18）6份，按2.2.3项下方法测定，获得其特征图谱，以8号峰（蛇床子素）为参照峰，计算其相对峰面积和相对保留时间。并计算RSD。各特征峰的相对保留时间RSD在0%～0.1%范围内，相对峰面积的RSD在0.1%～0.3%范围内，表明该特征图谱的重复性较好。

2.2.4.3 中间精密度考察 采用Waters UPLC H-Class，TUV检测器，取独活标准汤剂冻干粉（批号：180209-445800-18）6份，按2.2.3方法测定，获得其特征图谱，以8号峰（蛇床子素）为参照峰，计算其相对峰面积和相对保留时间。并计算RSD。

采用Waters UPLC H-Class，TUV检测器获得的特征图谱中，各特征峰的相对保留时间RSD在0%～0.1%范围内，相对峰面积的RSD在0%～0.4%范围内。不同仪器间相对保留时间RSD范围是0.1%～5.2%，相对峰面积RSD%范围是0.3%～5.1%，表明该特征图谱的中间精密度符合分析要求。

2.2.4.4 稳定性考察 取独活标准汤剂冻干粉（180209-445800-18），按2.2.3项下方法制备供试品溶液，分别于 0、2、4、8、12、24 h 按正文方法进行测定，获得其特征图谱，以8号峰（蛇床子素）为参照峰，计算其相对峰面积和相对保留时间。并计算RSD。稳定性实验结果可知，溶液中化学成分在24 h稳定性，各特征峰的相对保留时间RSD在0%～0.1%范围内，相对峰面积的RSD在0.1%～0.9%范围内。

2.2.5 质谱成分指认 质谱条件：Agilent Jet Stream ESI源，干燥气流速：11 L/min，干燥气温度：350℃，鞘气温度：400，鞘气流速：11 L/min，雾化器压力：35 psi，Fragmentor电压：130 V。正模式采集，喷嘴电压：500 V，毛细管电压：4 000 V；负模式采集，喷嘴电压：1 000 V，毛细管电压：3 500 V。

3 结果

3.1 样品检测 取18批次独活标准汤剂冻干粉，照2.2.2项下方法制备供试品溶液，再照2.2.3项下方法检测，结果见表 3，图 1、2。

表3 独活标准汤剂冻干粉样品列表

3.2 质谱成分指认 通过对特征图谱的紫外光谱信息及所采集的一级质谱图信息的研究，同时参考文献[11]对独活中的主要化学成分进行结构推测，结果见表4。

3.3 成分量化分析

3.3.1 主成分分析及聚类分析 采用2.2.3项下方法对18批独活饮片和18批独活标准汤剂冻干粉进行检测，经软件积分处理，得到相应特征图谱9个特征峰的峰面积。

图1 18批独活标准汤剂冻干粉液相图谱

图2 独活标准汤剂冻干粉对照图谱及共有峰标识

表4 特征峰质谱指认

采用SPSS 20.0统计软件对18批独活饮片和18批独活标准汤剂冻干粉特征图谱进行PCA，求出相关矩阵方差，见表5。以特征值＞1未提取标准，得到前两个主成分的累计方差贡献率为90.520%（大于80%），故选择前两个主成分即可进行评价，它代表了独活中9个成分量的90.520%的信息量，具有很好的代表性，足以评价独活饮片及独活标准汤剂的质量，进而用于独活配方颗粒特征图谱的分析[12-14]。

从表6中可以看出，第1个主成分的信息主要来自色谱峰 3、4、5、6、7、8，第 2 个主成分的信息主要来自色谱峰 1、2、9。

将PCA所得的两个主成分对18批独活饮片和18批独活标准汤剂冻干粉特征图谱进行打分，所得第1个和第2个主成分进行聚类分析，以组间连接和欧氏距离作为样品测度，采用Q型聚类进行HCA。

结果显示，独活饮片和标准汤剂冻干粉均可根据产地差异分为两大类，四川省和湖北恩施样品聚为一类，湖北宜昌聚为一类，煎煮以后的标准汤剂冻干粉单独聚为一类，并与饮片相区分，样品间的距离低于饮片之间的距离。

表5 解释的总方差

表6 成份矩阵a

3.3.2 饮片、标准汤剂化学成分转移概率的量化 取上述实验所得18批独活饮片（称样量使用收率折算）和18批独活标准汤剂冻干粉特征图谱，得到9个特征峰峰面积，计算特征峰在煎煮过程中的转移值，计算方式为标准汤剂冻干粉的峰面积/饮片的峰面积。

若转移值＞1，该成分在煎煮过程中以积累为主；若转移值小于1，该成分不易被水提取或分解为主。在整个煎煮过程中峰3、4、5、6以积累为主，峰1、7、8、9分解或不易转移，峰2在不同批次中出现了不同的变化趋势。

批次 1～6（四川）和 13～18（湖北恩施）的各峰转移情况相近，但是批次7～12（湖北宜昌）各峰转移与前两者有较大差异，主要体现在峰 2、4、8、9，见表 7、图4。

图3 聚类分析结果

4 讨论

中药配方颗粒是由单味中药饮片经提取浓缩制成的、供中医临床配方用的颗粒。但因中药配方颗粒受到原料、炮制加工、生产等多方面环节的限制，中药配方颗粒目前没有统一的国家质量标准。独活配方颗粒的质量标准建立也是迫在眉睫。根据国家药典委员会发布的《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》的要求，为了有效表征独活配方颗粒整体质量，需使用标准汤剂，本研究建立了对照特征图谱质量控制方法，可用于独活配方颗粒的产地来源鉴别及全面的质量控制。

图4 独活饮片和标准汤剂冻干粉特征图谱对比

表7 独活煎煮过程特征峰转移值

本实验建立了独活标准汤剂的UPLC特征图谱对照图谱，可以全面反映样品的内在质量，评价独活标准汤剂的内在质量。本方法在色谱柱型号、流速、柱温等方面还进行了相关耐用性考察，结果表明，本方法可适用于不同型号色谱柱，在柱温28～35℃、流速为0.28～0.32 mL/min之间耐用性良好。

结合PCA和HCA分析方法对独活的煎煮过程进行了分析，发现产地差异是导致独活原料和独活标准汤剂差异的主要因素，煎煮可缩小这种差异。独活煎煮过程，并非单纯的成分溶出及转移，还发生了相互转化。批次1～6（四川）和13～18（湖北恩施）的各峰转移情况相近，但是批次7～12（湖北宜昌）各峰转移与前两者有较大差异，主要体现在峰2、4、8、9。通过比较各特征峰的转移值，发现在整个煎煮过程中峰3、4、5、6以积累为主，以峰5的转化生成最多；峰 1、7、8、9分解或不易转移，峰 2在不同批次中出现了不同的变化趋势。经过质谱指认峰3、4、5、6可能为当归醇类化合物，可能是经过水煮以后，发生了水解，导致含量升高。

研究过程中，采用多元的评价方法可更加全面对独活标准汤剂特征图谱进行分析，所得结果更加全面、直观，进一步确定此方法可用于独活标准汤剂的质量评价。