酶联免疫法测定水产品中己烯雌酚残留量

张瑞凌，许亦真，刘建萍，李福伟，张冲

(1.齐鲁工业大学(山东省科学院)，山东省分析测试中心，山东 济南 250014；2.山东蓝城分析测试有限公司，山东 济南 250014)

己烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)是一种非甾体雌激素，能产生与天然雌激素相同的药理与治疗作用，于1938年由Dodds等[1]合成。己烯雌酚广泛用于妇科病的治疗，也作为动物促生长剂应用于畜禽生产中，同时在水产养殖等方面也有使用。多年研究证明，己烯雌酚对生物体具有致畸[2]、致癌[3]等危害。欧美等国从20世纪70年代开始先后颁布禁令，限制己烯雌酚的使用。1979年，世界各国开始严格控制己烯雌酚作为治疗药物使用[4]。2002年，《禁止在饲料和动物饮用水中使用药物品种目录》(农业部公告第176号)中禁止在饲料和动物饮用水中使用己烯雌酚及其盐、酯和制剂[5]，《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》(农业部公告第193号)将其列为食品动物禁用兽药[6]。在经济利益驱使下，国内仍有将己烯雌酚用于水产养殖的现象。因此，选取一种快速、准确、灵敏的检测方法检测己烯雌酚残留量，对于水产品的食品安全有重要意义。

目前用于己烯雌酚检测的方法主要有高效液相色谱法[7]、液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)[8]、气相色谱-质谱联用法[9]、放射免疫法[10]等。LC-MS/MS法分析结果准确，但前处理较为繁琐，所需仪器设备使用和维护费用昂贵，且需专业人员操作，检测成本高。酶联免疫法是我国水产行业中己烯雌酚检测的标准方法，具有灵敏度高、操作安全、检测速度快、仪器成本低等优点。酶联免疫法会出现假阳性结果，对操作人员的技术水平有一定要求，检出限也相对较高。本实验使用酶联免疫法对大量实际样品进行检测，选取LC-MS/MS法验证阳性样品中己烯雌酚的含量，以提高样品结果的准确性。

1 实验材料和仪器

1.1 仪器

多功能酶标仪及操作软件(美国BioTek公司)；氮吹仪(北京普立泰科仪器有限公司)；高速冷冻离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司)；旋转蒸发仪(日本东京理化公司)；高速分散均质机(上海标本模型厂)；Agilent 1200 RRLC-6410型三重四级杆串联质谱仪(美国Agilent公司)；Agilent 1200液相色谱仪(美国Agilent公司)；Eclipse XDB-C18色谱柱，2.1 mm×150 mm，5 μm(美国Agilent公司)。

1.2 试剂

己烯雌酚ELISA试剂盒(江苏美正生物科技有限公司)；氯化钠(上海国药有限公司)；乙腈(美国Thermo Fisher Scientific)；乙醇(上海国药有限公司)。

组织样品为市售鱼类，均来源于山东省内多地市超市及农贸市场。

1.3 仪器工作参数

质谱使用离子源：ESI，第一级四极杆温度：100 ℃，第二级四极杆温度：100 ℃，雾化压力：206.844 kPa，干燥气温度：350 ℃，干燥气流量：12 L/min，离子极性：负，质量扫描模式： MRM模式，母离子质荷比为267，子离子质荷比分别为251和371，碎裂电压均为140 V，碰撞能量分别为23 V和26 V。

液相色谱条件：以水(A相)和乙腈(B相)为流动相进行线性梯度洗脱，流速为300 mL/min，柱温30 ℃，进样体积10 μL。梯度洗脱条件：0～5 min，20%～50% B；5～7 min，50%～95% B；7～8 min，95%～95% B；8～8.01 min，95%～20% B；8.01～12 min，20%～20% B。

2 实验方法

2.1 样品制备

取出样品肌肉部分，剔除脂肪和结缔组织，切成小块后混匀，置冰箱中冷冻备用。

样品解冻后匀浆，准确称取1.0 g匀浆后的组织样本到离心管中，加入1 mL 30%氯化钠溶液和1 mL乙腈震荡1 min，再加1 g中性氧化铝和4 mL乙腈，震荡5 min后，4000 r/min离心5 min；取上清液2 mL于50 ℃氮气流下吹干；加入100 μL无水乙醇，震荡30 s，再加入900 μL标品/样本稀释液震荡混匀后，取上清作为样本溶液。

2.2 检测方法

将所需试剂及样品置于室温(20～25 ℃)平衡30 min以上；取50 μL标准品/样本到对应的微孔中，然后每孔加入工作浓度酶标物50 μL，于25 ℃避光反应30 min；将孔内液体甩干，每孔加300 μL洗涤液，充分洗涤5次后，拍干；每孔分别加入底物液A液和B液各50 μL，避光于25 ℃反应15 min；加入终止液50 μL/孔，用双波长450 nm/630 nm检测，在5 min内读完数据。

2.3 灵敏度实验

分别做6次标准曲线，得出半抑制浓度(IC50)。分别测定10个阴性鱼肉样品，测定结果的平均值加上3倍标准偏差，即为检出限。

2.4 准确度实验

在空白样品中进行低、中、高浓度加标回收实验，共进行7批检测。

3 结果与讨论

3.1 灵敏度测定结果

以计算的标准溶液相对吸光度值为纵坐标，以己烯雌酚0.0、0.1、0.3、0.9、2.7 μg/L浓度的对数为横坐标，分别做6次己烯雌酚标准液相对吸光度值与浓度的标准曲线，线性关系良好，如表1所示。

表1 己烯雌酚测定过程随行工作曲线及相关系数

实验测得10个阴性鱼肉样品中己烯雌酚含量分别为0.25、0.27、0.21、0.28、0.15、0.24、0.26、0.17、0.29、0.18 μg/kg，平均值为0.23 μg/kg，标准偏差为0.04 μg/kg，则该方法检出限为0.35 μg/kg。

3.2 准确度测定结果

取阴性实际样品加入相应浓度的标准溶液制备质控样品，进行实际样品加标回收率实验，共进行7次加标，测得结果如表2所示。

表2 己烯雌酚加标回收率

续表2

7批阴性样品在3个添加浓度的平均回收率在77%～91%，相对标准偏差2.20%～4.45%，说明该方法准确度良好。

3.3 假阴性率

用LC-MS/MS验证随机抽取的20份ELISA检测得到的阴性样品，均未检出己烯雌酚残留，则假阴性率为0，说明本方法具有良好的特异性。

3.4 假阳性率

检测水产样品260份，有1个阳性样品，测定浓度为1.2 μg/kg。对该样品用LC-MS/MS验证，质谱结果见图1。由图1可以看出该阳性样品经LC-MS/MS测定结果为阴性。

图1 己烯雌酚标准品及样品的MRM色谱图Fig.1 MRM chromatogram of standard DES and sample

4 结论

本文对酶联免疫法定量检测水产品中己烯雌酚的方法进行了验证。该方法中己烯雌酚检出限为0.35 μg/kg，加标回收率为77%～91%，方法满足农业部发布的《动物性食品中兽药最高残留限量》[11]的要求。本文采用的LC-MS/MS法避免了假阳性结果，酶联免疫法灵敏、分析快速、操作简单、检测效率高，适合大批量样品中己烯雌酚残留的筛查。