汶香附中生物碱类物质的提取及其体外抗氧化研究

吴会晗，韩 晨，丁丽雪，方永晟，王学震,何 珊

(山东中医药大学 药学院，山东 济南 250300)

香附为莎草科植物莎草(Cyperus rotundus) 的干燥根茎， 味辛、微苦、甘，性平，具有疏肝解郁、调经止痛、理气调中的功效，是中医常用妇科药。香附主要成分为挥发油类物质，也包括多种萜类化合物及其氧化物等[1]。香附还含有糖类、黄酮类、生物碱类等各种化合物， Jeong 等[2]从香附中分离鉴定出了 3 个生物碱化合物，分别为罗通定 A(rotundine A) 、罗通定 B(rotundine B)、罗通定 C(rotundine C)，其结构骨架是基于一种新的倍半萜烯类型[3]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

醋香附：购自济南宏济堂(北园路药店)，产地山东泰安；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基(南京建成生物科技有限公司)、2,2-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基(ABTS+)(上海远慕生物科技有限公司)；95%乙醇、甲醇、盐酸、氨水、雷氏铵盐、二氯甲烷、无水硫酸钠、丙酮、过硫酸钾均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-2000型紫外可见分光光度计；FA2004B型十万分之一电子分析天平：赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；粉碎机；旋转蒸发仪；水浴锅。

1.3 试验方法

1.3.1 香附生物碱制备

取一定量醋香附，洗净，烘干并用粉碎机研成粉末得到醋香附干粉。精确称取70.00 g香附粉末于索氏提取器中，用200 mL 95%乙醇进行索氏提取2 h。将乙醇倒出，取少部分等量溶液于两个小试管中，用5%的盐酸溶液酸化至pH值至5～6，各滴加改良碘化铋钾溶液与雷氏铵盐试液两滴进行生物碱的定性实验。将剩余乙醇溶液放置于蒸馏烧瓶中，蒸出乙醇直至烧瓶中仅剩20 mL液体，此时将液体倒入磨口锥形瓶中，加入100 mL 1%盐酸溶液，放置过夜后，抽滤，用氨水调节滤液pH值至9～10，用75 mL二氯甲烷萃取，分离有机相，用氨水调节上层清液pH值至 9～10，再用50 mL二氯甲烷萃取2次。合并所有萃取液，用40 g无水硫酸钠脱水1 h，将萃取液置于蒸馏烧瓶中，蒸出二氯甲烷，直至烧瓶内液体近干，再加10 mL丙酮溶液将残留物溶出，放置于磨口锥形瓶中。再于60℃下旋转蒸发，刮下生物碱提取物以供下述实验用。

1.3.2 香附生物碱抗氧化能力的测定

1.3.2.1 样品溶液制备

精确称取香附生物碱提取物0.06 g，使用甲醇溶液作为溶剂，配置质量浓度为4.0 mg/mL样品液。再使用甲醇将上述溶液分别稀释至0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL。

1.3.2.2 DPPH自由基清除率的测定

DPPH自由基为暗紫色棱柱状结晶，是一种很稳定的氮中心自由基，其醇溶液呈紫色，在波长520 nm左右有一强吸收。在DPPH自由基清除试验中，DPPH自由基与受试物给出的氢原子结合，使反应溶液的颜色变浅，吸光度变小。受试物的抗氧化活性可以根据实验组溶液吸光度的变化来判定。

参考单虹宇[4]方法，用无水乙醇配置0.1 mmol/L的自由基溶液，无光下保存该溶液，并使温度保持在5℃左右。取1.3.2.1中不同浓度的香附生物碱溶液2 mL与配置好的2 mL DPPH自由基溶液，混合两种溶液并充分振摇，避光条件下反应25 min，在520 nm波长处测定吸光度。按照下公式计算DPPH自由基的清除率。重复测定3次。

DPPH 自由基清除率(%) = (1-(As-Ab)/Ac)×100

式中：

As为样品组的吸光度值；

Ab为本底组的吸光度值；

Ac为空白组的吸光度值。

1.3.2.3 ABTS自由基清除率的测定

ABTS在氧化剂的作用下氧化成为绿色的自由基阳离子ABTS+·，ABTS+·易溶于水和酸性乙醇溶液，最大吸收值在734 nm左右。在ABTS自由基清除试验中，加入抗氧化物质后，部分ABTS+·自由基被清除，溶液的吸光度降低，得到香附提取物对ABTS+·的清除效果。在室温避光条件下将7 mmol/LABTS+水溶液和2.45 mmol/L的过硫酸钾反应15 h，制得ABTS+·自由基标准溶液。取该溶液适量，用蒸馏水将其稀释至OD734nm=0.700±0.005，制得ABTS+·自由基工作液。将0.1 mL ABTS+·自由基工作液3.9 mL与1.3.2.1中不同浓度的香附生物碱溶液混合并且充分振摇，避光条件下反应4～6 min，在波长734 nm处测定吸光度[5-6]。计算ABTS+·自由基的清除率并重复测定3次。

ABTS+清除率(%)=(1-(As-Ab)/Ac)×100

式中：

As为样品组的吸光度值；

Ab为本底组的吸光度值；

Ac为空白组的吸光度值。

2 结果与分析

2.1 香附生物碱对DPPH自由基清除率的测定

香附中生物碱对DPPH自由基有一定的清除作用，如图1为香附生物碱提取物对DPPH自由基的清除率。(生物碱对DPPH自由基的清除能力在(0.5～1) mg/mL内增加的幅度最大)，回归方程为：Y=0.7358 + 0.0807 X(式中X为样品浓度，Y为清除率)，半抑制率(IC50值)为0.173688 mg/mL。

表1 不同浓度生物碱的清除作用Table 1 Scavenging effects of different concentrations of alkaloids

图1 不同浓度生物碱的清除作用
Fig.1 Scavenging effects of different concentrations of alkaloids

2.2 香附生物碱对ABTS+自由基清除率的测定

由图2可见香附生物碱提取物对ABTS+有一定清除作用，且回归方程为Y=0.1838X+0.3466(式中X为样品浓度，Y为清除率)，半抑制率(IC50值)为 0.56383 mg/mL。

表2 不同浓度生物碱的清除率Table 2 Clearance of different concentrations of alkaloids

图2 不同浓度生物碱的清除率
Fig.2 Clearance of different concentrations of alkaloids

3 结论

本文探究了香附中生物碱提取的方法，以及其抗氧化活性，生物碱的定性实验结果表明，索氏提取可以提取出香附中的生物碱，并且提取出的生物碱具有一定的抗氧化能力，其清除ABTS+·自由基和DPPH自由基的IC50值分别为0.5638、0.1737 mg/mL。香附药用价值较高，分布广泛，香附中生物碱在目前研究还较少，可以对香附中生物碱进行进一步的研究。