邵氏“五针法”对哮喘模型大鼠肺组织а-SMA及FN表达的影响❋

李 真，邵素菊

(1. 许昌市中医院针灸科，河南 许昌 461000； 2. 河南中医药大学针灸推拿学院，郑州 450008)

支气管哮喘是呼吸系统的常见病和多发病之一。据统计，全球哮喘病患者有2.75亿人左右。我国支气管哮喘患病率大约为0.5%～6%[1],并以青少年和儿童居多[2]。本病多于夜间或清晨发作，大多数患者可自行缓解或经治疗缓解，但是本病易反复发作，迁延难愈，极大地影响了患者的生活质量。尤其是出现持续状态或大发作，若治疗不及时不正确，会加重病情甚至危及生命。

全国名老中医邵经明教授在大量的临床实践中，总结出治疗哮喘的独特疗法邵氏“五针法”，即“肺俞” “大椎” “风门”穴。对此其前期也进行了多项实验研究，但大多以炎症机制为主。本研究将目光聚焦于哮喘的气道重塑上。以气道平滑肌和细胞间质为主要病理改变的气道重塑作为哮喘发病的重要机理之一，具有十分重大的研究价值。a-SMA(平滑肌肌动蛋白-a)可调节气道平滑肌收缩、迁移及生长。FN(纤维连接蛋白)能调节细胞生长、迁移、分化和细胞外基质沉积以及上皮下纤维化，二者均在哮喘气道重塑中发挥重要作用。本研究通过对针刺前后哮喘模型大鼠肺组织中a-SMA及FN表达变化的观察，探讨邵氏“五针法”改善哮喘气道重塑的作用机制及针刺治疗哮喘的作用途径。

1 材料与方法

1.1 动物

选用40只体质量(140±20) g的健康雄性SD大鼠，购买于河南省实验动物中心，在河南中医学院动物实验室进行饲养。将大鼠按随机数字表法分为4组每组各10只。

1.2 试剂及仪器

卵蛋白(OVA)：美国Sigma公司(批号20130607)；地塞米松磷酸钠注射液：规格1 ml，5mg；江苏涟水制药有限公司(批号1310513)；氢氧化铝干粉：白银化学试剂厂(批号20130717)；a-SMA、FN免疫组化试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司提供(批号20130529B)；30号的0.5寸一次性毫针(“环球牌”0.30 mm×15 mm)；摊烤片机KT-218IV：湖北大维；自动包埋机 EG2150：德国徕卡；BH-2光学显微镜：Olympus公司；石蜡切片机RM3245：德国徕卡；MS彩色图像分析系统：上海申腾技术有限公司。

1.3 研究方法

依据《肺脏免疫学及免疫相关性疾病》[3]的方法来建立大鼠哮喘模型。在研究第8天对大鼠进行致敏，空白对照组用生理盐水腹腔注射，其余采用10%OVA抗原液1 ml取代生理盐水。从致敏后第15天起，在密闭的雾化箱内使大鼠雾化吸入1%OVA溶液(空白对照组采用生理盐水雾化)20 min激发哮喘，每日1次，共7次。每日雾化后进行治疗，针刺治疗组选取大鼠“肺俞”(双) “大椎” “风门”(双)[4]共针10 d。药物治疗组采用0.05%地塞米松磷酸钠溶液腹腔注射，每日1次，共10 d。空白对照组用生理盐水进行腹腔注射和雾化，模型对照组不做特殊治疗。最后1次治疗后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.35 ml/100 g)，然后迅速打开胸腔，剥离切取支气管右中下肺组织(包括肺门)，用生理盐水冲洗后迅速放入4%多聚甲醛中固定1周，切片待测进行免疫组化检测。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠行为、症状、体征观察

空白对照组：大鼠反应灵敏，行动敏捷，呼吸平稳，毛色光洁，饮食及大小便正常，生理盐水雾化吸入后无明显变化。模型对照组：OVA抗原激发后，大鼠出现喷嚏、呛咳、流涕、呼吸急促、抓鼻挠腮、烦躁不安、张口喘息等哮喘样表现，部分大鼠可闻及细小喘鸣音，反应迟钝，动作迟缓。针刺治疗组、药物治疗组：激发后体征同模型对照组。针刺或药物治疗10 min后，大鼠喷嚏、流涕、抓鼻挠腮、张口喘息症状明显减轻，30 min后呼吸频率、节律逐渐恢复正常，饮食、运动正常。

2.2 肺组织a-SMA和FN含量的表达

表1显示，空白对照组大鼠肺组织中少见胞浆呈棕黄色染色的a-SMA及FN阳性细胞；模型对照组与空白对照组比较，大鼠肺组织内二者阳性表达明显增多，差异有统计学意义(P<0.01)；针刺治疗组和药物治疗组与模型对照组比较，肺组织内二者阳性表达显著减少，差异有统计学意义(P<0.01)，但仍高于空白对照组。

表1 各组大鼠肺组织a-SMA、FN含量比较

注:4组比较：P=0.000<0.01；与空白组比较:☆P<0.01；与模型组比较：△P<0.01；与药物治疗组比较：▲P<0.01

图1～4显示，各组大鼠肺组织a-SMA免疫组化检测结果。

图1 空白对照组(免疫组化染色，10×40)

图2 模型对照组(免疫组化染色，10×40)

图3 药物治疗组(免疫组化染色，10×40)

图4 针刺治疗组(免疫组化染色，10×40)

图5 空白对照组(免疫组化染色，10×40)

图6 模型对照组(免疫组化染色，10×40)

图7 药物治疗组(免疫组化染色，10×40)

图8 针刺治疗组(免疫组化染色，10×40)

大鼠肺组织中少见胞浆呈棕黄色染色的阳性细胞。与空白对照组比较，阳性表达显著增多。与模型对照组比较，阳性细胞减少，α-SMA表达下降，但高于针刺治疗组。 与模型对照组比较，阳性细胞减少，α-SMA表达下降，但仍高于空白对照组。图5～8显示，各组大鼠肺组织FN免疫组化检测结果。大鼠肺组织中可见少量胞浆呈棕黄色染色的FN阳性细胞。与空白对照组比较，FN阳性表达显著增多。与模型对照组比较，阳性细胞减少，FN表达下降但仍高于针刺治疗组。与模型对照组比较，阳性细胞减少，FN表达下降。

3 讨论

哮喘是一种反复发作的痰鸣气喘疾患，中医认为哮喘的发病是由于宿痰伏肺，若遇诱因引触会使痰阻气道、气道痉挛，从而导致肺失肃降、气逆于上而致痰鸣气喘发作。哮喘宿根为痰，痰饮之产生常因肺不布散津液，脾不运化水湿，肾不蒸化水液，导致人体津液不归正化，凝聚成痰，内伏于肺而发哮喘。哮喘初病者其病位在肺，病程日久者可累及脾肾，但仍关乎肺。

气道平滑肌是哮喘气道重塑过程中的重要靶器官， a-SMA作为气道平滑肌的标志性指示物[5]，其生物学特性主要表现在，平滑肌中的粗细肌丝相互缠绕共同组成基本的收缩单位，它们是平滑肌收缩的结构基础。其中细肌丝所占比例较大，细肌丝主要由肌动蛋白组成，起主要调节作用[6]。炎症细胞及平滑肌细胞的趋化、游走和聚集主要依靠肌动蛋白纤维的伸展、收缩来实现，肌动蛋白含量的高低对平滑肌收缩能力具有直接影响。a-SMA不仅能够表达于气道平滑肌细胞，还可以表达于肌成纤维细胞，而且是肌成纤维细胞收缩能力的典型标志。a-SMA表达增多会刺激成纤维细胞转化为具有收缩能力的肌成纤维细胞[7]，从而加重黏膜下层的纤维化，引起气道重塑。a-SMA能够促使气道平滑肌的表型发生变化。哮喘时气道平滑肌的改变以收缩型为主，收缩型的气道平滑肌较分泌型表达更多的a-SMA[8]。a-SMA表达的增多会引起免疫反应性增高，加重气道高反应性和气道炎症[9]。

细胞外基质(ECM)是维持气道结构和功能的重要组成部分，它在气道平滑肌细胞的刺激下可产生成纤维细胞，导致上皮下纤维化，二者相互作用可加重炎症反应和气道重塑。FN是细胞外基质的主要组成成分，其生物学特性主要表现为纤维连接蛋白是细胞外基质中最主要的黏连性糖蛋白，是细胞外基质的主要组成成分[10]。细胞外基质在气道壁及肺间质沉积增多是哮喘气道重塑的重要病理变化之一。细胞外基质可以控制细胞迁移的速度与方向，FN可通过与细胞表面(主要是成纤维细胞)的受体结合而形成纤维，使网状层密度和厚度增加，促使上皮下纤维化的发生使基底膜增厚。气道平滑肌表型的可塑性是通过各个肌细胞的可逆性调节和分化来实现的，肌细胞可在细胞外基质主要是FN的刺激下发生收缩-合成表型的改变[11]。在哮喘发作过程中，气道上皮细胞能够通过产生炎症介质(如TGF-β1)刺激成纤维细胞，促进其合成和分泌多种细胞外基质，主要是纤维连接蛋白，从而增加上皮下细胞外基质沉积，使基底膜增厚而引起气道重塑并加重气道炎症[12]。

通过对大鼠行为体征观察、针刺或药物治疗后，大鼠的呼吸频率、节律以及活动能力逐渐恢复正常。免疫组化检测后发现，药物治疗组和针刺治疗组中a-SMA和FN阳性表达均有所下降，且针刺治疗组的阳性表达下降更为显著。说明邵氏“五针法”降低炎性渗出的程度，减少平滑肌细胞的增生、肥大，减轻上皮下纤维化程度，使气道高反应性下降，改善气道重塑，从而抑制哮喘的发展。以上研究说明，邵氏“五针法”能够降低a-SMA、FN在肺组织中的阳性表达，这是针刺改善气道重塑、治疗哮喘的作用机理之一。