丹绿补肾胶囊质量控制方法研究

张岩岩 周永妍 王文鹏

【摘 要】 目的：建立丹绿补肾胶囊质量控制方法。方法：采用薄层色谱法（TLC）对丹绿补肾胶囊中白花丹、绿包藤、射干及胡椒药材进行定性鉴别;采用高效液相色谱法（HPLC），以次野鸢尾黄素作为指标成分进行定量测定。结果：薄层色谱法能清晰地鉴别丹绿补肾胶囊中的白花丹、绿包藤、射干及胡椒，阴性无干扰，专属性强;次野鸢尾黄素在1.097～32.91μg/mL（r2=0.9999）质量浓度范围内与峰面积具有良好的线性关系;平均回收率（n=9）为100.6%，RSD为1.28%。结论：所建立的方法准确、可靠、专属性强， 可作为丹绿补肾胶囊的质量控制方法。

【关键词】 丹绿补肾胶囊;质量控制;薄层色谱;高效液相色谱;次野鸢尾黄素

【中图分类号】R284 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2019）1-0023-04

Abstract：Objective  To establish the method of quality control of Danlv Bushen Capsules. Methods Plumbago zeylanica L.，Tinospora crispa （Linn.） Hook. f.& Thoms.， Belamcanda chinensis （L.） DC， Piper nigrum L.in Danlv Bushen Capsules. were identified by TLC，and Irisflorentin as index components was determined by HPLC.Results Danlv Bushen Capsules could be detected by TLC， The linearity ranges obtained from the calibration curves of Irisflorentin was 1.097～32.91μg/mL （r2=0.9999）. The average recoveries of Irisflorentin was 100.6% （n=9） and RSD was 1.28%. Conclusion  This method is simple， accurate， selective and highly reproducible. It can be used for the quality control of Danlv Bushen Capsules.

Keywords： Danlv Bushen Capsules;Quality Control; TLC;HPLC; Irisflorentin

丹绿补肾胶囊是由白花丹、绿包藤、射干、胡椒和干姜五味药组成的（傣药）复方制剂，主要功效为补肾滋阴壮阳。用于阴阳两虚所致阳痿遗精、腰膝酸软和身体乏力[1]。现行国家标准为国家食品药品监督管理局局颁药品标准WS-10436（ZD-0436[BF]）-[BFQ]2002-2012Z，其中鉴别项下包括白花丹、绿包藤、胡椒的薄层鉴别;含量项下包括胡椒碱含量测定。本次研究重新建立了丹绿补肾胶囊的薄层鉴别方法，增加射干薄层鉴别[2-6]，修订了白花丹、绿包藤及胡椒薄层鉴别方法。且以上4个药材的薄层鉴别采用同一供试品溶液即可完成;同时采用高效液相色谱法，增加次野鸢尾黄素的含量。实验结果表明所用方法操作简便、专属性好、灵敏度高、快捷准确，可用于该制剂的质量控制，并且可完善和提高丹绿补肾胶囊的质量标准。

1 仪器与试药

1.1 仪器 KH3200E型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）;CPA225D型电子分析天平（德国赛多利斯）;HH-2型电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）;TDL-60B型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）;国产薄层预制G板（青岛海洋化工厂分厂）;国产薄层预制GF254板（青岛海洋化工厂分厂）;瑞士CAMAG REPROSTAR 3薄层色谱数码相机成像系统;安捷伦1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）。

1.2 试药 次野鸢尾黄素对照品（批號：111557-200602）、胡椒碱对照品（批号：110775-201405，纯度98.9 %）、白花丹对照药材（批号：121370-200401）、绿包藤对照药材（批号：121371-200401）、射干对照药材（批号：120994-201206）均购自中国食品药品检定研究院;丹绿补肾胶囊（批号：17041761、17041861、1704196，1云南神威施普瑞药业有限公司）;各阴性对照样品根据处方及制法自制，所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 白花丹的薄层色谱鉴别 取本品内容物1g，加甲醇5mL，超声提取30min，过滤，滤液作为供试品溶液。另取白花丹对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典2015年版四部  通则0502）试验，吸取上述两种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（30～60℃）-三氯甲烷-甲醇（8∶4∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铝乙醇溶液，105℃加热2min，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。白花丹阴性对照无干扰，方法具专属性。如图1所示。·

2.1.2 绿包藤的薄层色谱鉴别 取绿包藤对照药材1g，加甲醇5mL，超声处理30min，滤过，滤液作为对照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典2015年版四部  通则0502）试验，吸取鉴别（1）项下的供试品溶液5μL、上述对照药材溶液10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（8∶5∶1.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%磷钼酸乙醇溶液，在100℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。绿包藤阴性对照无干扰，方法具专属性。如图2所示。

2.1.3 射干的薄层色谱鉴别 取射干对照药材1g，加甲醇5mL，超声处理30min，滤过，滤液作为对照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典2015年版四部  通则0502）试验，吸取鉴别（1）项下的供试品溶液及上述对照药材溶液各5μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-丁酮-甲醇（3∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。射干阴性对照无干扰，方法具专属性。如图3所示。

2.1.4 胡椒的薄层色谱鉴别 取胡椒碱对照品，加甲醇制成每1mL含4mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2015年版四部  通则0502）试验，吸取鉴别（1）项下的供试品溶液及上述对照药材溶液各2μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲醇（10∶3∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。胡椒阴性对照无干扰，方法具专属性。如图4所示。

2.1.5 方法验证 上述薄层鉴别均分别采用3 种来源不同的色谱板，分别在低温（约7 ℃）、常温（20～25℃）、高温（30～35℃）、低湿度（相对湿度30 %）、高湿度（相对湿度75 %）进行考察，结果均获得良好色谱分离效果。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse plus C18 （5μm，250mm×4.6mm）;流动相：乙腈-0.2%磷酸（41∶59）;检测波长：266nm;流速1mL/min;柱温为40℃;进样量10μL。

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取次野鸢尾黄素对照品适量，加甲醇制成每1mL含次野鸢尾黄素10μg的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液制备 取丹绿补肾胶囊内容物0.35g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25mL，称定重量，超声处理（功率250W，频率50kHz）20min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性对照溶液制备 按处方比例分别制备不含射干药材的样品，依照“2.2.3”项下方法制成阴性样品溶液。

2.2.5 专属性试验 分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液10μL，按上述色谱条件进样测定，结果表明阴性样品在与供试品中次野鸢尾黄素相同的保留时间处无干扰峰。如图5所示。

2.2.6 线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液1、2、5、10、20、30μL，注入液相色谱仪进行测定。以峰面积为纵坐标，以进样量为横坐标进行线性回归，得次野鸢尾黄素的回归方程及相关系数为y=4257.1x+5.9621，r2=0.9999（n=6）。结果表明次野鸢尾黄素在1.097～32.91μg/mL范围内线性关系良好。如图6所示。

2.2.7 精密度试验 取同一批号（批号17041761）的供试品溶液，连续进样5次，每次进样10μL，按峰面积计算：次野鸢尾黄素相对标准偏差（RSD）为0.2%。结果表明精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 取同一批号（批号17041761）的供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h进样10μL进行测定，按峰面积计算：次野鸢尾黄素的相对标准偏差（RSD）分别为1.6%。结果表明样品在24h内稳定。

2.2.9 重复性试验 取同一批样品（批号17041761），取0.175g、0.35g、0.525g各3份，精密称定，按“2.2.3”项下方法制成供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定。按含量计算：次野鸢尾黄素的相对标准偏差（RSD）分别为0.8%。结果表明本方法重复性良好。

2.2.10 加样回收率试验 精密称定已知含量的丹绿补肾胶囊（批号：17041761）內容物9份，每份0.175g，分成3组，每组分别精密加入相当于样品中所含次野鸢尾黄素量的50%、100%、150%的对照品贮备液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率。结果见表1。

2.2.11 样品含量测定 取3批样品，每批平行取样2份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，记录色谱峰面积，按外标一点法计算样品中次野鸢尾黄素的含量。结果见表2。

3 讨论

3.1 薄层鉴别方法的优化 射干药材的薄层鉴别方法研究过程中参考《中国药典》2015年版“射干”药材[6]项下薄层鉴别方法，并对此方法进行了优化，将聚酰胺薄膜更换为硅胶GF254薄层板，删除“喷以三氯化铝试液”步骤，将365nm下检视改为254nm下检视，使此方法更加简便，易于操作。

原标准中[1]白花丹、绿包藤、胡椒的薄层鉴别分别为3个供试品溶液，且处理步骤复杂，处理时间较长，使用有机溶剂种类及数量较多。通过实验摸索发现，以上3味药材薄层色谱供试品溶液可与射干鉴别采用同一溶液，经验证，4个鉴别方法阴性均无干扰，方法耐用性好。本方法易于普及掌握，有效提高了检测效率，降低了检测成本，减少了环境污染。

3.2 含量测定方法选择

3.2.1 提取溶剂的选择 取同一批样品（批号：17041761）适量，分别采用75%甲醇、甲醇、75%乙醇及乙醇为提取溶剂，同时超声提取20min进行考察，结果表明甲醇提取含量最高，故选择甲醇为提取溶剂。

3.2.2 提取方式的选择 取同一批样品（批号：17041761）适量，以甲醇为提取溶剂，分别采用超声、回流两种方式进行提取，结果表明两种方式含量基本一致，考虑到操作方便，因此选择超声提取。

3.2.3 提取时间的选择 取同一供试品（批号：17041761）4份，以甲醇为提取溶剂，分别超声10、20、30、40min，按拟定色谱条件测定，结果表明超声20min之后含量基本相同，故选择超声20min为提取时间。

3.2.4 波长的选择 取一定浓度的对照品溶液，于190～400nm下扫描，结果显示次野鸢尾黄素在266nm处有最大吸收，因此选择266nm作为检测波长。

3.2.5 色谱条件的选择 研究参考文献方法[7-10]，分别考察了甲醇-水系统及乙腈-水系统，结果发现乙腈-水系统效果较好;又分别考察乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水和乙腈-0.2%磷酸水系统，通过比较发现，乙腈-0.2%磷酸水系统效果较好，故本实验最终选择乙腈-0.2%磷酸水系统。同时对色谱柱（Accrom  XAqua C18、Welch Ultimate XB- C18、Agilent ZORBAX Eclipse plus C18、Kromasil 100-5 C18、Phenomenex Luna C18（2）、Accrom Unitary C18）、柱温（25、30、35℃）、流速（0.8、1.0、1.2 mL·min-1）、酸度（0.1%、0.2%、0.3%磷酸水溶液）及流動相比例进行了耐用性考察，结果发现色谱峰分离度受上述色谱条件影响不大，耐用性较好。为获得最好的分离效果，最终确定了实验所需色谱条件。

综上，本研究在现行质量标准的基础上增加了射干薄层鉴别，优化了白花丹、绿包藤及胡椒的薄层鉴别方法，使得鉴别工作变得高效、环保;增加了射干中黄酮类有效成分次野鸢尾黄素的含量测定。试验方法简便快速，灵敏度高，专属性强，重复性好，结果可靠，提高完善了其质量标准，可以作为本品的质量控制方法，为丹绿补肾胶囊的全面质量控制提供了新手段，以有效控制药品质量。

参考文献

[1]国家食品药品监督管理局.国家药品标准WS-10436（ZD-0436）-2002-2012Z.

[2]刘倩，陈金月，文隽，等.麻杏二陈汤煮散质量标准[J].中国实验方剂学杂志， 2015， 21（9） ：71-73.

[3]刘韶，雷鹏，李新中，等.芪黄颗粒的薄层鉴别[J].湖南中医学院学报， 2004， 24（1） ：26-27.

[4]田成旺，郭建华，张科，等.射黄含片的质量标准研究[J].中成药， 2013， 35（2） ：302-305.

[5]柯发敏，张开莲，钟明镜.咽炎含片中药材的薄层色谱研究[J].中药与临床， 2010， 1（3） ：27-28.

[6]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015：285.

[7]李欣妍，邹桂欣，尤献民，等.气管炎丸中野鸢尾黄素含量测定[J]. 辽宁中医杂志， 2016， 43（7） ：1450-1452.

[8]王晓月，邸子真，王光函，等.黄芩射干汤中千层纸素A 和次野鸢尾黄素的含量测定[J]. 实用药物与临床， 2017， 20（5） ：563-565.

[9]邹桂欣，尤献民，王光函，等.野鸢尾中异黄酮与其抗炎作用的相关性分析[J].中华中医药学刊， 2016， 34（10） ：2406-2408.

[10]李锁，张晓瑞， 尤献民，等.小儿咽扁颗粒中野鸢尾黄素和白射干素含量测定方法研究 [J].辽宁中医杂志， 2015， 42（9） ：1733-1735.

[11]曹岳华，彭国庆.高效液相色谱法测定射干利咽口服液中射干苷、次野鸢尾黄素的含量[J].中南药学， 2010， 8（6） ： 431-434.

（收稿日期：2018-11-13 编辑：陶希睿）