香菇多糖在体外对白血病HL-60细胞凋亡及PI3K/AKT信号通路的影响*

马 莉 ， 荣 芳△， 王建宾， 张年萍， 刘 宏

(山西大同大学 1医学院临床医学系， 2呼吸病与职业病研究所， 山西 大同 037009)

白血病是一种血液系统的恶性肿瘤，发病机制复杂且预后情况较差[1-2]。目前，多药物联合化疗仍是治疗白血病的重要手段[3]。香菇提取物，例如香菇多糖(lentinan)，已被证实对癌细胞具有抑制增殖和促进凋亡的活性[4]。香菇多糖属于免疫激活性多糖，是一种肿瘤临床治疗药物，可提高肿瘤患者的免疫力[5]。研究表明，一些天然植物提取物可通过抑制白血病细胞中的信号通路来抑制细胞增殖，促进细胞凋亡[6-10]，其中，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/AKT)是体内重要的信号转导通路之一。多项研究表明，白血病细胞中存在PI3K/AKT信号通路的持续活化[11-13]。因此，本实验以人急性髓系白血病HL-60细胞为研究对象，检测香菇多糖对其凋亡的影响，并检测与细胞凋亡密切相关的PI3K/AKT信号通路的关键分子的表达情况，为阐明香菇多糖诱导白血病细胞凋亡的分子机制提供新的实验依据。

材 料 和 方 法

1 材料

香菇多糖购自日本味之素株式会社(每支1 mg)；HL-60细胞为本实验室传代培养；RPMI-1640培养液购自GIBCO；胎牛血清购自浙江四季青生物科技有限公司；青霉素、链霉素、总蛋白提取试剂盒和胞浆蛋白提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；MTT、Annexin V/PI凋亡试剂盒及二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma；兔抗人PI3K、Akt和p-Akt单抗购自Cell Signaling；鼠抗人GAPDH单抗购自Santa Cruz；PI3K抑制剂LY294002购自碧云天生物基因技术公司。

2 方法

2.1 细胞培养 HL-60细胞在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的条件下，培养于含有10%灭活胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI-1640培养液中，每隔1～2 d换液传代1次，选对数生长期细胞进行实验。

2.2 MTT法检测香菇多糖对HL-60细胞活力的影响 离心收集对数期、形态生长良好的HL-60细胞，接种于含RPMI-1640培养液的96孔板上(终浓度为2.0×107～2.5×107/L)，每孔100 μL。同时加入香菇多糖，使其浓度为15 mg/L、30 mg/L和45 mg/L(分别记为15 mg/L lentinan组、30 mg/L lentinan组和45 mg/L lentinan组)，对照组加入相应体积的灭菌生理盐水(记为0 mg/L lentinan组)，每个浓度设8个复孔，5% CO2、37 ℃、饱和湿度条件下进行培养。分别于培养24 h、48 h和72 h后加入MTT(5 g/L)，每孔10 μL，4 h后加入DMSO，酶标仪测量各个时点490 nm处吸光度(A)值。重复3次。细胞抑制率(%)=(1-A实验组/A对照组)×100%。

2.3 Annexin Ⅴ-FITC/PI 双染流式细胞术检测香菇多糖及PI3K通路抑制剂LY294002对HL-60细胞凋亡的影响 分别收集浓度为0 mg/L、15 mg/L、30 mg/L和45 mg/L香菇多糖(分别记为0 mg/L lentinan组、15 mg/L lentinan组、30 mg/L lentinan组和45 mg/L lentinan组)及5 mg/L LY294002(记为LY294002组，control组为0 mg/L LY294002处理组，即加入等体积的灭菌生理盐水)处理72 h的HL-60细胞悬液，离心去上清，以结合缓冲液重悬细胞，制成单细胞悬液。取100 μL细胞依次加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，充分混匀，避光室温孵育15 min。加入400 μL结合缓冲液，转移至5 mL玻璃管，用流式细胞术进行分析，检测结果使用CellQuest软件分析各组细胞凋亡率。[注：我们前期实验得出，LY294002对人白血病细胞HL-60的半数抑制浓度(IC50)约为1.4 μmol/L(处理时间为72 h)，故用5 mg/L LY294002处理HL-60白血病细胞。]

2.4 Western blot实验 参照试剂盒说明书步骤分别提取经30 mg/L香菇多糖作用后0 h、24 h、48 h和72 h的HL-60细胞的总蛋白和胞浆蛋白(分别记为0 h组、24 h组、48 h组和72 h组)，并以BCA法对总蛋白定量。将蛋白上样至SDS-PAGE凝胶进行电泳分离后，转膜。取PVDF膜浸入含5%脱脂奶粉的封闭液中封闭1 h。加入1 500倍稀释的抗cleaved PARP、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9、cytochrome C、β-actin、PI3K、AKT、p-AKT和GAPDH抗体于4 ℃下孵育24 h。经封闭液洗涤后，加入1 5 000倍细胞的II抗于37 ℃下孵育1 h。暗室内加入ECL化学发光剂显影后，凝胶成像系统扫描分析。

3 统计学分析

实验结果采用SPSS 21.0统计软件分析，结果采用均数±标准差(mean±SD)表示。两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较使用单因素方差分析，组间均数的两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 香菇多糖可抑制HL-60细胞的活力

与0 mg/L lentinan组相比，HL-60细胞经香菇多糖处理后，细胞活力受到抑制。处理后24 h、48 h和72 h，香菇多糖均能以浓度依赖性的方式抑制细胞活力；15 mg/L、30 mg/L和45 mg/L香菇多糖处理均能以时间依赖性的方式抑制细胞活力(P<0.05)，见表1。

表1 不同浓度的香菇多糖在处理不同时间对HL-60细胞活力抑制率的影响

Table 1. The effects of lentinan at different concentrations for different time on the viability inhibitory rate of HL-60 cells (%.Mean±SD.n=3)

Group24 h48 h72 h0 mg/L lentinan0.000.000.0015 mg/L lentinan18.65±3.25*25.24±2.68*#30.26±3.46*#30 mg/L lentinan25.58±2.32*36.67±2.88*#48.85±3.97*#45 mg/L lentinan30.89±3.59*46.27±4.02*#60.85±4.15*#

*P<0.05vs0 mg/L lentinan group;#P<0.05vs24 h group.

2 香菇多糖促进HL-60细胞的凋亡

利用流式细胞术检测HL-60细胞经不同浓度(0 mg/L、15 mg/L、30 mg/L和45 mg/L)香菇多糖处理72 h后的凋亡情况。与0 mg/L lentinan组相比，随着香菇多糖浓度的增加，细胞凋亡率增多逐渐增加(P<0.05)，见图1。这说明香菇多糖促进HL-60白血病细胞的凋亡。

Figure 1. The effects of lentinan at different concentrations on the apoptosis of HL-60 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mg/L lentinan group.

图1 不同浓度香菇多糖对HL-60细胞凋亡的影响

3 香菇多糖诱导HL-60细胞凋亡过程PARP剪切增加

MTT实验证实香菇多糖对人白血病细胞HL-60的IC50约为30 mg/L(处理时间为72 h)，故用30 mg/L香菇多糖处理HL-60白血病细胞。处理过后，利用Western blot检测香菇多糖诱导HL-60细胞凋亡过程中cleaved PARP蛋白的水平。结果显示与0 h组相比，cleaved PARP蛋白的表达水平随着处理时间的增长明显升高(P<0.05)，见图2。这证明香菇多糖诱导HL-60细胞凋亡过程中PARP剪切增加。

Figure 2. The protein level of cleaved PARP during apoptosis of HL-60 cells induced by lentinan.Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 h group.

图2 香菇多糖诱导HL-60细胞凋亡过程中cleaved PARP蛋白水平的变化

4 香菇多糖诱导HL-60细胞中caspase-9和caspase-3激活

HL-60细胞经30 mg/L香菇多糖处理后，Wes-tern blot检测香菇多糖诱导HL-60细胞凋亡过程中cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和cleaved caspase-8的表达水平。结果表明，与0 h组相比，cleaved caspase-9和cleaved caspase 3的蛋白水平随着处理时间的增长明显升高(P<0.05)，而cleaved caspase-8变化的差异没有统计学显著性，见图3。

Figure 3. The protein levels of cleaved caspase-9, cleaved caspase-3 and cleaved caspase-8 during the apoptosis of HL-60 cells induced by lentinan. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 h group.

图3 香菇多糖诱导HL-60细胞凋亡过程中cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和cleaved caspase-8蛋白水平的变化

5 香菇多糖诱导的HL-60细胞凋亡是线粒体cytochrome C的释放介导的

HL-60白血病细胞经30 mg/L香菇多糖处理后，Western blot检测香菇多糖诱导HL-60细胞凋亡过程中胞浆中cytochrome C的蛋白水平。结果表明，与0 h组相比，cytochrome C的蛋白水平随着处理时间的增长明显升高(P<0.05)，见图4。

Figure 4. The protein level of cytochrome C during the apoptosis of HL-60 cells induced by lentinan. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 h group.

图4 香菇多糖诱导HL-60细胞凋亡过程中cytochrome C蛋白水平的变化

6 香菇多糖对HL-60细胞PI3K/AKT信号通路的影响

HL-60细胞经不同浓度香菇多糖处理72 h后，Western blot检测香菇多糖对HL-60细胞PI3K/AKT信号通路的影响。结果显示，与0 mg/L lentinan组相比，PI3K、AKT和p-AKT的蛋白水平随着香菇多糖浓度的增加明显降低(P<0.05)，见图5。这说明香菇多糖诱导的HL-60白血病细胞凋亡过程中PI3K/AKT信号通路被抑制。

Figure 5. The effects of lentinan at different concentrations on the protein levels of PI3K/AKT signaling pathway-related molecules in the HL-60 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mg/L group.

图5 不同浓度香菇多糖对HL-60细胞PI3K/AKT信号通路的影响

7 PI3K通路抑制剂LY294002 诱导HL-60细胞凋亡

利用流式细胞术检测HL-60细胞经5 mg/L LY294002处理72 h后的凋亡情况。与control组相比，PI3K抑制剂LY294002促进HL-60细胞凋亡(P<0.05)，见图6。

Figure 6. The effects of PI3K inhibitor LY294002 on the apoptosis of HL-60 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图6 PI3K通路抑制剂LY294002对HL-60细胞凋亡的影响

讨 论

据估算，全球每年有14万左右的人被诊断为白血病，大多数为急性白血病，是我国十大高发恶性肿瘤之一[13-14]。多药物联合化疗是临床上治疗白血病最常规的方式，但是，受到化疗药物耐受以及不良反应等因素的影响，白血病的整体疗效及预后情况并不理想。因此，探寻不同作用机制的药物来与常规化疗药物联合治疗白血病是临床研究的重要内容[15]。

多糖是生物体内的重要组成成分，具有多种生理功能，如增强免疫、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老和降血糖等[4]。香菇多糖分子主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖及阿拉伯糖等组成[16]。目前香菇多糖可应用于临床，通过提高机体的免疫力，作为辅助药物配合胃癌患者的化疗[17]。当前的研究成果虽未阐明香菇多糖抗肿瘤特性的具体机制，但是，抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡被认为是一种可能的机制[18]。本研究发现，香菇多糖对HL-60细胞的活力有抑制作用，并且这种抑制具有浓度依赖性和时间依赖性。

细胞凋亡的发生途径主要包括死亡受体介导的外部凋亡途径、内部线粒体途径、颗粒酶B介导的细胞凋亡途径及内质网应激途径等。其中，内部线粒体途径是由cytochrome C释放介导的。Caspase-9被激活后，启动了caspase-3在内的caspase级联反应过程，cytochrome C从线粒体内膜释放到胞浆中[19]。本研究表明，香菇多糖可通过诱导HL-60细胞凋亡达到抑制其生长的效果。在香菇多糖诱导HL-60细胞凋亡的过程中caspase-9和caspase-3被激活，cleaved caspase-8的蛋白水平没有变化，且cytochrome C的蛋白水平随着处理时间的增长明显升高。说明香菇多糖是通过线粒体途径诱导HL-60细胞凋亡。

PI3K/AKT信号通路作为细胞内重要的信号转导通路之一，通过影响下游多种效应分子的活化状态，在淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病等细胞增殖及凋亡方面起关键作用；AKT是PI3K重要的下游分子，活化的AKT可使caspase-9磷酸化而失活，从而抑制细胞的线粒体凋亡途径[20-21]。PI3K/AKT信号通路在白血病中发挥着重要的调控作用，该通路的激活受到抑制后，能够直接调控白血病细胞的凋亡过程[22-24]。本研究通过检测香菇多糖处理后HL-60细胞内PI3K、AKT和p-AKT等蛋白的表达情况发现，香菇多糖以浓度依赖性的方式抑制上述3种蛋白的水平，从而使PI3K/AKT信号通路受阻。为了明确使用PI3K/AKT信号通路受到抑制后是否能诱导HL-60细胞凋亡，我们利用PI3K通路抑制剂LY294002处理HL-60细胞。对细胞凋亡情况进行分析，发现凋亡细胞数量增加，且与香菇多糖处理效果类似，说明PI3K/AKT信号通路的活化受到抑制后，可直接调控HL-60细胞凋亡。

综上所述，我们推测香菇多糖可通过抑制PI3K/AKT信号通路来诱导HL-60白血病细胞凋亡。