茄褐纹病菌的分离鉴定及培养基筛选

马珂

摘  要：对茄褐纹病菌的形态及适宜培养基类型进行了分析，在茄子的不同发病部位分离出α型、β型2种分生孢子;实验结果显示，燕麦培养基是最适宜褐纹病菌产孢的培养基，其次为PSA。

关键词：茄褐纹病菌;分离鉴定;培养基;筛选

中图分类号 S436.411文献标识码 A文章编号 1007-7731（2019）10-0074-03

褐纹病（Phomopsis vexans）是茄子重要的病害之一，主要危害茄子果实，影响果实的商品性。一般造成果腐发生率在20%～30%[1]，严重的高达80%[2，3]，茄子采种田因褐纹病的大发生而导致种子严重减产，甚至绝收。

茄褐纹病菌属半知菌亚门球壳孢目拟茎点霉属，病斑上产生的黑色分生孢子器初埋生于寄主表皮下，成熟后突破表皮而外露;孢子器单独地生子座上，呈凸透镜形，具有孔口，在自然状态下，Phomopsis的分生孢子器多数仅含有α-型孢而无β-型孢，年佳续[4]综合论述了拟茎点霉属的检测技术，认为形态学鉴定的传统方法仍是主要鉴定方法之一。罗利娟[5]对8种拟茎点霉在不同培养条件下的产孢情况进行了研究，以其解决自然条件下拟茎点霉属的鉴定问题。陈永青、姜子德[6，7]分别用分子生物学的方法对多种拟茎点霉属真菌进行了系统研究，结果表明，Phoma与Phomopsis两属之间缺乏明显的区分界限，在Phomopsis的分类地位上仍存在着界限模糊的问题。周永力[8]对Phomopsis的个体发育做了较为具体的阐述，主要涉及人工培养条件下的Phomopsis的产孢形式、孢子形态及菌落的生长特点等方面。油球是Phomopsis属的一个稳定的特征，可作为该属的判断依据。温度成为影响孢子类型产生不同的主要因素，传统观点认为，不同类型的孢子形态的产生是与所发病的植株部位有关，在自然状态下，Phomopsis的分生孢子器大多仅含有α-型孢而无β-型孢。本研究通过对采集样本的徒手切片、镜检，以及筛选适宜培养基等方法，在较短时间内用较为经济的手段，对茄褐纹病菌进行准确的初判，并对茄褐纹病菌的产孢条件进行了进一步研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 HA、HB采自安徽合肥，HY采自安徽和县。

1.1.2 供试培养基 PDA培养基。

1.2 仪器及试剂 光学显微镜，显微摄像显微镜 （OLYMPUS），解剖刀，镊子，剪刀，培养皿，载玻片，盖玻片，恒温箱。

1.3 实验方法

1.3.1 病原菌分离纯化 采用PDA培养基进行常规组织分离法，于25℃培养纯化，记录菌落的形态和颜色，同时对病组织进行徒手切片、镜检，观测病原菌形态。并按柯赫氏法则[9]加以确认，获得茄褐纹病菌菌株3株，分别编号HA、HB、HY。

1.3.2 培养基筛选

1.3.2.1 实验培养基的制备 （1）PSA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL;（2）PSA+VB1培养基：在原有PDA培养基成分中添加5mg维生素B1;（3）燕麦培养基：燕麦片30g，琼脂20g，水1000mL;（4）胡萝卜培养基：200g胡萝卜榨汁，25g琼脂，水1000mL;（5）大豆培养基：干豆140g浸泡数小时后磨浆榨汁，琼脂4g，水1000mL;（6）玉米培养基：玉米粉300g，琼脂17g，水1000mL;（7）蛋白胨培养基：蛋白胨5g，蔗糖10g琼脂14g，水1000mL;（8）查彼培养基：蔗糖30g，硝酸钠2g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，琼脂17g，水1000mL;（9）茄汁培养基：茄子200g榨汁，琼脂25g，水1000mL。

1.3.2.2 菌丝生长速率的测定 将茄褐纹病菌菌株HA、HB、HY分别在PDA斜面上活化3d，然后转移至PSA平板上培养5d。在培养好的菌落平板上沿菌丝生长边缘用打孔器打直径为6mm的小菌碟，分别移置不同培养基平板的中央，3次重复。25℃条件下恒温培养，3d后按十字交叉法测量菌落的直径，取平均值，测定生长速率。

2 结果与分析

2.1 茄褐纹病病原的鉴定 茄褐纹病菌存在2种分生孢子：α型及β型分生孢子。α-型孢子为单孢，无色、长圆柱形、球形、梭形，1端或2端较尖，有1～2个大油球或两端各聚集多个小油球。β型呈细长线状，并在一端弯曲成钩，两者均为无色单胞。经镜检得知，寄主发病部位不同，其分生孢子类型有明显差异：果实上分离的分生孢子有2种类型，其中多数为α型分生孢子，伴有少量的β型分生孢子;从茎秆上的病斑采集到的都是β型分生孢子;叶片上的均为α型分生孢子。各部位分生孢子形态见图1，分生孢子器形态见图2。

2.2 培养基的筛选 3个褐纹病菌菌株在9种培养基上的培养性状及产孢情况结果见表1，菌株生长情况结果见图3。由表1可知，能够产孢的培养基有PSA、燕麦、玉米、胡萝卜，其产孢量依次为燕麦>PSA≥玉米>胡萝卜，产孢时间除胡萝卜培养基的时间在15d以上外，其他3种培养基的产孢时间都在10d以上。由图3可知，菌丝生长较好的培养基种类有PSA、茄汁、玉米，不適合菌丝生长培养基为查彼和蛋白胨。3个菌株在不同的培养基上的菌丝生长情况存在差异，HA菌丝生长最适的培养基为茄汁培养基，HB最适的为玉米培养基，HY最适的为PSA培养基。HB在9种培养基上的菌丝生长情况总体上优于HY、HA，HA的菌丝生长为最低，在产孢情况上，3个菌株的表现较为一致。

3 讨论

茄褐纹病菌2种类型的分生孢子（β型和α型）2端的油球，已经成为Phpmopsis的分类标志。笔者在实验中观察到，α型分生孢子的油球多数情况下保持在2个（1端1个），在极少数情况下，可以观察到有3个油球存在。这一特征不仅是自然条件下形成的分生孢子，而且是人工条件下形成的分生孢子所共有的。而对于β型分生孢子，除在自然条件下较少见到外，因其不具有生殖能力，所以在一般人工培养条件下无β型分生孢子出现。目前，国内对茄褐纹病菌的分类研究仍较少，因实验采集的菌株较少，研究存在着很大的局限性，有待于进一步深入。