与ADHD相关的外周循环microRNA芯片筛选及分析

朱 萍 潘 景 张 帆 吴丽慧

注意缺陷多动障碍(attention-deficit hyperactivity disorder，ADHD)是以注意力不集中、活动过度、冲动为特征的一种神经行为障碍，并伴有认知障碍和学习困难[1]。在全球儿童中的发生率约3%～5%，而60%～80%患儿的症状可持续至青少年或者成年，是儿童常见的神经精神障碍之一。目前ADHD的发病机制与病因比较复杂，还尚不明确，但多数研究者认为是遗传因素与环境因素相互作用的结果，同时也与大脑结构与功能异常有关。ADHD的主要诊断依据美国精神病学会《精神障碍诊断与统计手册》第5版(DSM-V)儿童ADHD临床诊断标准，即问卷调查的方式[1]。目前还没有可靠的分子诊断标记。

非编码小RNA(microRNA, miRNA)通常源于1个大小约为1000bp的长链RNA初始转录产物(pri-miRNA)，pri-miRNA分子在细胞中经过双链RNA特异性RNsae Ⅲ-drosha的作用下形成70～100nt具有茎环结构的前体microRNA (pre-miRNA)。Pre-miRNA在exportion-5的作用下转运至胞质中，被另一个双链RNA特异性RNsae Ⅲ-dicer识别，进一步切割成为成熟miRNA。miRNA与肿瘤、心血管疾病、糖尿病、人类遗传性疾病甚至神经系统重大疾病的发生、发展密切相关。在中枢神经系统中miRNA含量特别丰富，其功能涉及神经发育、分化、退行性变、凋亡等，同时也涉及记忆、精神发育迟缓等方面，但miRNA在神经发育与活动中的作用还存在广泛的未知性[2,3]。研究报道帕金森综合征患者的血清中miR-133b，脑皮质组织中miR-205,表达量是显著降低的；重度抑郁患者外周血中miR-132表达量增加，并且是通过结合在甲基-CpG结合蛋白(MeCP2)和脑源性神经营养因子(BDNF)的mRNA上的3′非翻译区(3′UTR)，使MeCP2、BDNF表达下降，从而影响重度抑郁症的发生、发展[4～6]。因此笔者猜测，和正常儿童比较，ADHD患儿外周循环中是否可能存在一组miRNA表达量有显著性差异，这些改变的miRNA可能成为ADHD潜在的诊断标记，故本研究采用miRNA 芯片技术筛选出在ADHD患儿外周血清中差异表达的miRNA。

对象与方法

1.研究对象：实验样本来自2015年10月～2016年2月在笔者医院就诊的ADHD患儿20例，符合实验标准的健康儿童60例。按照年龄和性别配对形成ADHD儿童∶正常儿童=1∶3的病例组20对。(1)病例组(ADHD)儿童纳入标准：①6～18岁儿童；②根据美国精神病学会《精神障碍诊断与统计手册》第5版(DSM-V)儿童ADHD临床诊断标准，排除精神发育迟缓、品行障碍、情绪障碍、学习障碍及各种精神疾病等；③通过详细的体格检查、神经系统检查、精神状况检查与相关实验室辅助检查，排除躯体疾病及神经系统疾病；④智商>70；⑤班主任综合评定认为在语文和数学方面无明显的学习困难，期末考试成绩在全班平均成绩减1个标准差以上；⑥近2周内未使用精神药物治疗。(2)对照组(非ADHD组)儿童的纳入标准： 通过详细的体格检查、神经系统检查、精神状况检查与相关实验室辅助检查，排除精神发育迟缓、品行障碍、情绪障碍、学习障碍及各种精神疾病，排除躯体疾病及神经系统疾病的健康儿童。该研究遵守《赫尔辛基宣言》，通过了笔者医院医学伦理学委员会批准。该研究的目的、方法、可能后果及健康保证均向儿童监护人交待清楚，所有监护人均签署知情同意书。

2.标本收集：ADHD儿童和正常儿童采血前休息20～30min，通过肘静脉采血4ml，室温静止1h，4℃ 10000r/min，离心10min，用取样器将上清液(血清)吸取到无菌试管，血清标本储存于-80℃冰箱。

3.microRNA 芯片筛选差异表达microRNA：所有样本都用miRcute血清/血浆miRNA提取分离试剂盒(北京天根生化公司)抽提总RNA，使用美国Agilent公司人miRNA芯片V21.0(agilent human miRNA microarray V21.0)测试各组microRNA的表达量，该微阵列取自miRBase 21版数据库，包含2549条人类miRNA的探针。每一张载玻片上包含8个单独的微阵列，每个具有1900个功能。阵列包括48个阴性对照，用于估计荧光背景和背景差异，每个微阵列的样品量为100ng，用Cy3标记后，每张载玻片经 XDR Scan (PMT100，PMT5)扫描得到信号。打开agilent scan control software扫描芯片获得miRNA的信号图像，用agilent feature extraction(AFE) software version 10.7.1.1分析可以得到所有的芯片和miRNA信号值。这些信号经消除背景后登陆SBC analysis system(http：//sas.ebioservice.com)进行统计分析。选择hsa-miR-1273g-3p为内参，原因为，①在所有样本内均有检出；②标准差(SD)较小，在样本间变化幅度小；③平均信号值较高，一般认为>30的信号值(log2后约为>5)相对更可靠，因此选用该内参进行校正。

4.实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)验证:(1)引物设计：对改变量>2倍的miRNA进行实时荧光定量PCR验证，根据miRNA序列设计引物(引物由苏州泓迅生物科技股份有限公司合成，miR-30d-5p反转录引物:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTTCCA-3′，检测引物:5′-GTTGTTGTAAACATCC-3′； miR-4655-3p反转录引物:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCCCG-G-3′，检测引物:5′-TGTTGACCCTCGTCA-3′； miR-7641发转录引物:5′-GTCGTATCCAGTGC-AGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCTTAG-3′，检测引物:5′-CTCGTTTGATCTCGG-3′；内参miR-1273g-3p反转录引物:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTCAG-GC-3′，检测引物:5′-TCTAGTAACCACTGCACTC-3′，这4个miRNA在进行PCR检测时均用miR-223a作为反向互补链5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′)。(2)RT：将抽提的血清总RNA通过反转录酶(M-MLV，日本TaKaRa公司)获得cDNA. RT体系及条件为：先加样Ⅰ体系(RNA 5μl，无菌水5μl，反转录引物1μl，内参引物1μl)混匀后，反应条件为70℃，10min,冰上5min；再加样Ⅱ体系(5×RT buffer 4μl，10mol/L dNTP 1μl，无菌水2μl，M-MLV 1μl)混匀后，反应条件为30℃ 10min，42℃ 60min，70℃ 10min。(3)定量PCR: cDNA通过探针法实时监测PCR过程，最后用2-ΔΔCt法对基因表达进行相对定量。定量PCR体系及条件：2×Taqman Mix(CW0932S，康为世纪)5μl，引物(40μmol/L)0.0625μl+0.0626μl，通用探针0.125μl，无菌水3.25μl，cDNA1.5μl，反应条件95℃预变性10min，95℃ 15s,60℃ 1min。50个循环。

4.统计学方法：芯片结果选择内参miR1273g-3p在所有样本内的中位值为基准，将所有信号值减去该值。把对照组3个信号值取平均值后与ADHD患儿组进行配对T检验，实时荧光定量PCR结果也采用配对T检验分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.microRNA 芯片初筛结果:同对照组60例健康儿童比较，在年龄相仿、性别一致的情况下，ADHD患儿血清中miR-30d-5p、miR-19b-3p，miR-6085、miR-19b-3p、miR-6749-5p、miR-6826-5p、miR-3960等61个microRNA的表达量在20例ADHD患儿中均有改变(表1)。其中改变量>2倍即fold change<0.5的是 miR-30d-5p， miR-4655-3p和miR-7641，表1中前3个，这3个miRNA在各样本中的信号值(图1)，上方文本为样本编号，左侧文本为microRNA(探针)编号，每一行代表1个基因(探针)，每一列表示1个样本。颜色越红代表miRNA在对应样本中的表达量越高，颜色越蓝代表miRNA在对应样本中的表达量越低。

表1 ADHD相关的外周循环microRNA芯片筛选

图1 miR-30d-5p、miR-4655-3p、miR-7641热图

2.实时荧光定量PCR验证：将实验组(20例ADHD患儿)和对照组(60例健康儿童)的芯片结果表达量改变>2倍的miR-30d-5p、 miR-4655-3p和 miR-7641在上述80例样本中进行实时荧光定量PCR验证，结果显示，和对照组比较，miR-30d-5p、 miR-4655-3p和 miR-7641在ADHD患儿外周血清中相对表达量降低(P=0.000)，与芯片筛选出的miRNA在ADHD中的表达趋势一致(图2)。

图2 被筛选的miRNA在ADHD中的表达趋势A.miRNA-30d-5p的相对表达量;B.miRNA-4655-3p的相对表达量;C.miRNA-7641的相对表达量

讨 论

ADHD是儿童最常见的神经精神障碍之一，主要表现为注意力不集中、多动和冲动，可分为注意力缺陷型、多动/冲动型和混合型，发病可延续到成年。美国儿科学会(American Academy of Pediatrics，AAP)2011年版ADHD指南指出，初级保健医生应当认识到ADHD是一种慢性状态，有着特殊的保健需要，若没有维持长期治疗，将会造成很大影响。其原因在于其有发展为破坏和过度冒险行为，品行障碍，学习困难，情感问题的潜在风险，而这些非核心症状将影响到儿童各个方面如学业成就、成长及生活质量，给自身、学校、家庭和社会带来极大负面影响[7]。迄今为止，ADHD的发病机制和病因未能完全清楚，大多数研究者认为中枢神经系统中多巴胺能、5-羟色胺能(5-HT)、去甲肾上腺素能的异常表达是ADHD的主要发病机制，而ADHD的主要诊断也是依据量表的形式，无分子诊断标记[8～10]。

miRNA参与控制许多细胞/分子过程，如细胞凋亡、增殖和分化[11, 12]。近年来，研究发现miRNA在中枢神经系统中含量特别丰富，其功能涉及神经发育、分化、退行性变、凋亡等，同时也涉及记忆、精神发育迟缓等方面。本课题组首先利用ADHD大鼠模型SHR和正常对照模型Wistar Kyoto(WKY)大鼠比较，测得SHR的脑前额区(PFC)存在半乳凝素3(Galectin-3)及miR-let-7d的表达异常，并且发现miR-let-7d直接作用于Galectin-3的3′UTR从而负性调控Galectin-3的表达，同时Galectin-3的降低能抑制TH的表达，而TH是多巴胺代谢过程的关键酶[13]。为此笔者进一步收集了35例ADHD患儿和35例门诊体检儿童，检测到血清miR-let-7d的水平在ADHD组明显高于对照组；在所收集到的ADHD患儿中，混合型占60%之多，因此推测miR-let-7d的高表达在混合型可能更加突出[14]。笔者还利用ADHD大鼠模型发现了和对照组WKY大鼠比较，SHR的前额皮质区域的miR-34c*、miR-138、miR-138*、miR-296和miR-494表达显著下降，经过启动子序列分析和活性测定，确定了糖皮质激素受体(Nr3c1)能够使miR-34c *、miR-138-1、miR-296和miR-494基因的启动子活性及其转录得到抑制。同时测得在SHR的PFC中，Nr3c1表达异常升高。另一方面，笔者还通过荧光素酶报告得到miR-34c*、miR-138、miR-138*、miR-296和miR-494能结合在转录因子Bhlhb2(Bhlhe40)信使RNA(mRNA)的3′非翻译区上，从而抑制了Bhlhb2基因的表达。同样地，Bhlhb2表达在ADHD模型SHR的PFC中也显著高于对照。

为了进一步观察Bhlhb2在SHR体内的作用，与对照组比较，敲除Bhlhb2基因能显著改善SHR的活动过度[15]。这些研究结果表明，Nr3c1-Bhlhb2轴失调参与了注意力缺陷和多动症的发展。结合本课题之前研究，认为存在一组miRNA在ADHD上是有表达差异的，笔者想从ADHD患儿获得直接的证据。故本研究通过基因芯片技术，在年龄和性别一样的条件下，ADHD患儿外周血清中有61个miRNA较正常儿童降低，取fold change>2倍的miR-30d-5p、miR-4655-3p、miR-7641进行实时荧光定量PCR验证，趋势同芯片结果一致。但是这些差异miRNA与ADHD之间的相互作用还有待进一步研究，有研究报道miR-30d-5p在阿尔兹海默症患者外周血中表达量升高，并且与亨廷顿舞蹈病有关，目前还没有研究miR-4655-3p与miR-7641在神经系统疾病的报道[16,17]。笔者猜测这些差异miRNA可能通过调控靶基因来影响ADHD的病情发展。

综上所述，miR-30d-5p、miR-4655-3p和miR-7641在ADHD患者外周血清中降低明显，因此认为这3个miRNA有可能作为临床诊断ADHD的指标之一，但是由于本研究中样本数量有限，后续实验笔者将扩大样本量，验证结果的可靠性，以及差异miRNA是否会随着ADHD病情好转或者药物治疗后表达量改变，有待后续追踪随访情况。同时笔者将着重于预测靶基因，查阅相关文献分析靶基因功能，探讨miRNA靶基因与ADHD之间可能存在的潜在关系。