自然发酵酸浆中一株高产酸菌的分离与鉴定

佟梓沂,孙秀宇,王 冰,杨 杨,石彦国,王世杰,朱 宏,张 娜,*

(1.哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江省普通高等学校食品科学与工程重点实验室,黑龙江哈尔滨 150076; 2.河北科技大学生物科学与工程学院,河北石家庄 050000; 3.石家庄君乐宝乳业有限公司,河北石家庄 050221)

本研究采用平板涂布法[7]并以各分离菌株在黄浆水中的代谢能力作为评价指标,从云南宣威特色黄豆腐制作所用自然发酵酸浆中分离筛选出优势产酸菌种,并将其进行细胞形态学、生理生化学及分子生物学鉴定,以期实现酸浆豆腐的工业化、标准化、稳定化、安全化生产。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

自然发酵酸浆样品 取样自云南宣威市倘塘镇黄豆腐加工作坊;黄浆水 实验室自制;卤片 天津市鑫达宇化工有限公司;MRS肉汤培养基、MRS固体培养基 北京奥博星生物技术有限责任公司;盐酸、碳酸钙 均为分析纯,天津市天力化学试剂有限公司;草酸铵结晶紫染色液 北京索莱宝科技有限公司;Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒、SanPrep柱式DNAJ胶回收试剂盒、DNA Ladder Mix maker 上海生物工程有限公司。

VD-650超净工作台 济南创日新仪器设备有限公司;AR224CN型电子分析天平 上海天平仪器有限公司;DHP电热恒温培养箱 常州菲普实验仪器厂;MLS-3781-PC型立式压力蒸汽灭菌器 厦门理化仪器有限公司;PHS-3C pH计 上海雷磁仪器厂;TG16-W高速离心机 江苏捷达离心机制造有限公司;SP-BM-30光学显微镜、SU1510扫描电子显微镜 上海BM光学仪器制造有限公司;ABI3730-XL测序仪 天津基景公司;FR980凝胶成像仪 上海复日科技。

1.2 实验方法

1.2.1 黄浆水的制备 实验室以卤水为凝固剂点制豆腐[8],取豆腐压制过程中产出的黄浆水1000 mL,115 ℃灭菌15 min加入10%取自云南的酸浆样品使其发酵产酸,待黄浆水pH下降至4.0以下即为一代酸浆。以一代酸浆为豆腐凝固剂点制豆腐[9],取压制后剩余的黄浆水同样灭菌处理后接入10%一代酸浆进行自然发酵,待pH降至4.0以下即可作为二代酸浆进行点制豆腐。如此循环三代后可消除卤水中离子对实验的影响。本实验自制黄浆水为三代后酸浆点制豆腐过程中所产生的,自制黄浆水pH在5.5～5.8之间,直接作为培养基用于分离菌的培养。

1.2.2 高产酸菌的分离、纯化 采用平板涂布法,将用无菌生理盐水稀释107倍后的酸浆样品涂布于MRS分离培养基平板上,37 ℃恒温静置培养18～24 h,挑取有明显溶钙圈的单菌落进行反复分离划线,结合表观判断与镜检，纯化3～4代并进行4 ℃菌种斜面保存以及-20 ℃甘油管冻存。

镜检:取单菌落在无菌环境下于载玻片上涂成菌膜,经干燥、固定后用草酸铵结晶紫进行染色,30 s后用水冲洗并用吸水纸吸取多余的水。制好的片用显微镜在100倍油镜下观察,观察并记录菌体形态以判断菌落中是否有杂菌存在。

1.2.3 高产酸菌的筛选 将分离纯化得到的四株产酸菌接入MRS肉汤培养基，于37 ℃恒温培养24 h进行扩大培养后，按5%的接种量接种于黄浆水培养基中，37 ℃恒温培养48 h,每6 h测定不同菌种发酵液的pH与总产酸量,对分离菌种的产酸量和pH下降速率进行比较、筛选,对筛选获得的菌株进行鉴定。

1.2.4 产酸量的测定 取5.00 mL发酵液放入250 mL的锥形瓶中，用去CO2水适当稀释,加入5滴0.1%酚酞指示液,摇匀,用邻苯二甲酸氢钾标定的0.1 mol/L氢氧化钠滴定至微红色,30 s内不褪色,记录氢氧化钠标准溶液消耗量,按如下公式计算产总酸量[10]。

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式中:C2-产酸量,g/L;C1-NaOH溶液浓度,mol/L;K-酸换算系数,用乳酸表示,K=0.090;F-试液稀释倍数;V1-NaOH滴定发酵液消耗的体积,mL;V2-NaOH滴定空白对照消耗的体积,mL;V3-待测发酵液体积,mL。

1.2.5 高产酸菌的形态特征观察及生理生化特性 对筛选获得的高产酸菌株进行菌落形态观察,拍照。将菌种培养液以5000 r/min的速度离心5 min,取菌体加入2.5% pH6.8的戊二醛置于4 ℃冰箱固定1.5 h以上,取出后用0.1 mol/L的酸性磷酸缓冲液冲洗2～3次,每次10 min。然后对菌体依次用浓度为50%、70%、90%的乙醇进行脱水,每次10～15 min。脱水后的菌体样品用无水乙醇与纯叔丁醇1∶1的混合液置换后于-45 ℃进行冷冻干燥4 h,干燥后的样品镀金,利用电子扫描显微镜观察菌体细胞形态特征[11]。

对筛选出的高产酸菌株进行常规生理生化鉴定,试验包括革兰氏染色实验、过氧化氢酶实验、硝酸盐还原实验、硫化氢实验、明胶液化、吲哚试验实验以及对乳糖、木糖、蔗糖、果糖、棉子糖、麦芽糖、甘露醇、麦芽糖、鼠李糖、核糖、纤维二糖的发酵试验[12]。

1.2.6 乳酸菌序列测定与系统发育分析

1.2.6.1 细菌基因组DNA的提取 利用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取DNA。

1.2.6.2 细菌基因组PCR 扩增 上游引物为5′-CAGAGTTTGACCTTGG-3′(7F);下游引物为:5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′(1540R)。PCR 扩增反应体系扩增体系:成分Template(基因组DNA 20～50 ng/μL)0.5 μL,10×Buffer(with Mg2+)2.5 μL,dNTP(各2.5 mmol/L)1 μL,F(10 μmol/L)0.5 μL,R(10 μmol/L)0.5 μL,加ddH2O至25 μL。PCR扩增反应程序:94 ℃预变性4 min,94 ℃变性45 s 30 cycles,55 ℃退火45 s 30 cycles,72 ℃ 1 min 30 cycles,72 ℃修复延伸10 min,4 ℃储藏,终止反应。反应完成后,取3 μL PCR产物进行1%琼脂凝胶电泳检测,确认PCR扩增片段。PCR产物的回收:PCR产物用SanPrep柱式DNAJ胶回收试剂盒回收,具体操作按试剂盒说明书进行。序列测定:取各个菌种纯化后的PCR产物,使用测序仪进行DNA 测序。将扩增好的DNA进行鉴定。

1.2.6.3 系统发育树的建立 将鉴定出的基因序列在NCBI通过BLAST进行比较,确定种属及亲缘关系,即为16S rDNA的鉴定结果[13]。对基因序列进行ITS同源性分析并建立系统发育树。

1.3 数据处理

实验数据利用Excel软件和SPSS 19.0软件进行分析处理,用MEGA 5.0软件对菌株的基因序列进行系统发育分析。

2 结果与分析

2.1 高产酸菌的分离筛选

从云南宣威自然发酵酸浆中分离出4 株产酸菌分别编号为T-01、T-02、T-03、T-04,以总产酸量与体系pH下降速率为考察指标,测定四株菌在黄浆水中的代谢能力。结果如图1、图2所示,菌株T-02在黄浆水中发酵48 h后pH下降至3.6以下,总产酸量可达40.8 g/L,均高于其它菌株,且培养24 h后pH便下降至3.6,总产酸量达35.3 g/L。利用菌株T-02发酵时,黄浆水pH下降最快,产酸速率最高,产酸总量最大。

图1 发酵液产酸量变化曲线Fig.1 Change in acid yield of fermentation broth

图2 发酵液pH变化曲线Fig.2 Change in pH value of fermentation broth

其他学者也曾对自然发酵酸浆中的高产酸菌进行分离鉴定,叶青等[14]曾在豆腐酸浆中分离出一株产酸乳酸菌,在黄浆水中发酵24 h后产酸量达27 g/L,经鉴定为干酪乳杆菌;乔支红等[15]在豆腐酸浆老汤中分离出一株高产乳酸菌,发酵24 h后产酸量达43 g/L,经鉴定为屎肠球菌。王国良在豆腐酸浆中分离到一株嗜酸乳杆菌,黄浆水中发酵24 h酸度达到24.9 g/L[16]。刘倩等[17]在传统发酵酸浆中分离出一株解淀粉乳杆菌,在黄浆水中发酵24 h,产酸量为30 g/L。本研究从云南宣威自然发酵酸浆中分离筛选出一株高产酸乳酸菌T-02,该菌株在黄浆水中经24 h发酵产酸量高达35.3 g/L,pH下降至3.6,发酵48 h最高产酸量达到40.8 g/L,其产酸能力优于其他研究人员分离得到的产酸微生物,因此将本实验分离菌株应用到酸浆发酵和酸浆豆腐制作中有助于缩短发酵时间,提高生产效率。

2.2 分离高产酸菌体形态观察及生理生化实验

图3、图4分别为分离得到的高产酸菌株的菌落形态特征图和菌体扫描电镜图。据菌落及菌体扫描电镜图可以看出,菌株T-02 在MRS固体培养基上生长良好,菌落直径在1～3 mm之间,为不透明乳白色的正圆形,顶部微凸起,边缘整齐,菌落表面湿润有光泽,易挑起。通过电子扫描电镜观察可知该菌株细胞形态为两端圆的短杆状,不运动,无芽孢,无鞭毛,符合典型乳酸菌的形态学特征[18]。

图3 菌株 T-02菌落形态(10×)Fig.3 The colony morphology of strain T-02(10×)

图4 菌株T-02扫描电镜图(5000×)Fig.4 Scanning electron micrograph of strain T-02(5000×)

参照伯杰氏《常见细菌系统分类学手册》[19],对菌株T-02进行的生理生化实验结果见表1。

由表1可以看出菌株T-02是革兰氏阳性菌,过氧化氢酶试验、淀粉水解试验、H2S试验、明胶液化、硝酸盐还原、吲哚试验、V. P试验均呈阴性,葡萄糖酸盐试验为阳性,可利用木糖、蔗糖、果糖等大多数糖进行发酵,但不能利用鼠李糖。对照伯杰氏《 常见细菌系统分类学手册》可知,该菌株部分生理生化特性与糖发酵试验结果,初步判断该菌株为厚壁菌门,乳杆菌科,乳杆菌属。

表1 菌株生理生化特性Table 1 Strain physiological and biochemical characteristics

2.3 分子生物学鉴定

将提取到的菌株T-02的部分DNA基因序列(基因序列长度为1517 bp)在NCBI上进行BLAST比对发现T-02号菌株的基因序列与植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)基因序列相似性均高达99%。对菌株的基因序列进行系统发育分析[20],得到系统进化树如图5所示。

图5 菌株T-02系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree of strain T-02

由系统发育树可知,该分离菌株T-02与菌株LactobacillusplantarumKP144184.2(植物乳杆菌)、菌株LactobacilluspentosusFJ542297.1(戊糖乳杆菌)具有最高的基因序列相似度。根据细胞形态学特征,该分离菌株与其他自然发酵食品中分离出来的植物乳杆菌菌落及细胞形态及其相似[20-23]。在生理生化特征方面,该分离菌株T-02除不能利用鼠李糖作为第一碳源外可利用乳糖、果糖等其他糖作为第一碳源,这些与植物乳杆菌的特征最为接近,因此可结合细胞形态学,生理生化及分子生物学鉴定,将该分离菌株T-02确定为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。

3 结论

从云南宣威自然发酵酸浆中分离出四株产酸菌,对四株产酸菌进行复筛,筛选出一株高产酸菌T-02。该菌株在黄浆水中发酵24 h后pH下降至3.6,产酸量为35.3 g/L,发酵48 h达到最高产酸量为40.8 g/L,pH下降至3.6以下。该菌株在所有分离产酸菌中pH下降速率最快,产酸量最高,具有较好的产酸能力,可以作为酸浆豆腐的酸浆纯菌种发酵菌株。通过菌落形态和菌体细胞形态观察,结合生理生化试验、16s RNA鉴定及基因序列的比对,可确定该分离高产酸菌株为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。