白头翁汤剂对3种常见食源性致病菌的体外抑菌效果研究

林诗涵

（福建省产品质量检验研究院 国家加工食品监督检验中心[福州]，福建 福州 350002）

食源性致病菌，是指可以引起食物中毒或以食品为传播媒介的致病性细菌。食源性致病菌约有几十种，通常易引发食源性疾病的致病菌主要有以下7种[1,2]：致病性大肠埃希菌、沙门氏菌、志贺氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌。据统计，世界上70%的食源性疾病均由致病微生物所引发。近年来，部分畜牧业生产者片面追求产量和经济效益，违规使用违禁药品，给人类健康带来危害。2017年6月22日农业农村部印发了《全国遏制动物源细菌耐药行动计划（2017-2020年）》，并提出推进兽用抗菌药物减量化使用、优化兽用抗菌药物品种结构等5条行动目标[3]。而中草药作为我国传统的药用资源，具有疗效可靠、抗菌、毒副作用小、不易产生耐药性等优点[4,5]，是筛选高效、安全抗菌药物的重要来源。

白头翁汤始载于张仲景的《伤寒论·厥阴篇》，“热利下重者，白头翁汤主之”，是一味经典的热毒下痢良方。现代药效学研究表明，白头翁汤具有抗菌、抗炎、抗溃疡、促进免疫调节、抑制动物肠管运动、抗腹泻、对抗内毒素对机体的损害的功效[6]。对于细菌性痢疾[7-8]和溃疡性结肠炎[9]有着良好的治疗效果。另外，在畜牧医学上也可用于治疗动物痢疾，比如猪痢[10]和牛痢[1]。本实验选择鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌为对象，进行白头翁汤剂的体外抑制试验，旨在为后续食源性疾病的临床用药和研究提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材

白头翁、黄柏、黄连、秦皮购于福建中医药大学承创堂药店，由福建中医药大学药学院鉴定。

1.1.2 菌种

鼠伤寒沙门氏菌（CGMCC1.1174）购置于中国微生物菌种保存中心；志贺氏菌（ATCC25931）和金黄色葡萄球菌（ATCC25923）购置于北京陆桥责任有限公司。

上述菌种由福建省产品质量检验研究院微生物室鉴定并保存（菌种代数＜5代）。

1.1.3 试剂

营养琼脂、胰酪胨大豆肉汤（TSB肉汤）、Mueller-Hintonation肉汤（M-H肉汤）、血平板、氯化钠、环丙沙星和75%乙醇。

1.1.4 仪器

AF-20中药粉碎机、索氏提取装置、HB 10 S96旋转蒸发仪、115043真空泵、DLIO-1000液循冷却器、HH-6数显恒温水浴锅、HVE-50自动高压灭菌器、电热鼓风干燥箱、LRH系列37℃恒温培养箱、QT-1旋涡混合器、FG101727游标卡尺、Whatman’s No.06无菌定性滤纸和6 mm打孔器，等。

1.2 方法

1.2.1 药液的制备

取白头翁15 g，黄柏12 g，黄连6 g，秦皮12 g置于中药打粉机中粉碎至粗粉状。将药材粗粉放进滤纸筒内，轻压使其平实后将滤纸筒装入索氏提取器，用8倍量的75%乙醇回流提取1 h，重复3次，合并提取液，减压抽滤；用旋转蒸发仪蒸发浓缩，至无醇味。将药液浓缩至流浸膏状（每1 mL约含原药材1 g），作为供试药液[11]。

1.2.2 菌液的制备

将鼠伤寒沙门氏菌的标准菌株划线接种到血平板上，置于37 ℃下恒温培养24 h，挑选适宜的菌落接种到10 ml的TSB肉汤中，置于37 ℃的恒温培养24 h。

将培养好的菌悬液稀释至1麦氏浊度（细菌浓度约1×108 CFU/mL），4 ℃冷藏备用[12]。

志贺氏菌、金黄色葡萄球菌样液依照同样的方法制备。

1.2.3 含菌培养皿的制备

倾注融化并冷却至46 ℃的营养琼脂培养基15 mL于无菌培养皿内，制成营养琼脂平板。分别取上述制备好的菌悬液稀释至106 CFU/mL菌含量，与冷却至46 ℃的营养琼脂培养基按1∶10的比例混合，充分混匀后取10 mL于上述制备好的营养琼脂平板上，轻轻摇动平板使菌液均匀铺平，制成含菌平板。

1.2.4 K-B纸片法[13]抑菌试验

每个含菌平板上贴3张空白圆纸片，使3张圆纸片呈正三角形分布，且每张纸片的距离不小于32 mm，分别吸取10 μL的供试药液、浓度为50 μg/mL的环丙沙星溶液和0.85%生理盐水缓缓滴加在圆纸片上，使其充分吸收，每种菌做2个平行样。

将平板置于4 ℃的冰箱中活化2 h，后转入37 ℃的恒温培养箱中，正置培养24 h。观察并用游标卡尺测量所形成的抑菌圈的直径大小，采用十字交叉法，测量3次，取平均值[14]。

1.2.5 最小抑菌浓度（MIC）及最小杀菌浓度（MBC）测定

采用二倍稀释法[15]测定。取10支灭菌M-H肉汤试管，编号1～10#。1～8#试管加入1 mL等比浓度的白头翁汤剂，使1～8#小试管浓度分别为0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078125、0.00390625 g/mL。取供试菌液（细菌浓度约106CFU/mL）1 mL分别加入1～9#，9#为不加供试药液的阳性对照，10#加入供试白头翁药液，作为不加供试菌液的阴性对照。

将10支试管于37 ℃的恒温培养24 h后取出，充分混合均匀后，用移液枪吸取100μL混合液，于营养琼脂培养基上面，均匀涂布，至液体完全吸收。放置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，取出并观察细菌的生长情况，无细菌生长试管清澈透明的最低药物浓度为药物对细菌的最小抑菌浓度（MIC），以肉眼观察细菌被100%灭杀的浓度为药物对细菌的最小杀菌浓度（MBC）。

2 结果

2.1 K-B纸片法抑菌结果

白头翁汤剂对鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌的体外抑菌作用见表1。抑菌圈直径＞20 mm 为高度敏感（+++），15～20 mm 为中度敏感（++），8～15 mm 为轻度敏感（+），＜8 mm为耐药或无抑制活性（-）[14]。

2.2 白头翁汤剂的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度

2.2.1 鼠伤寒沙门氏菌的MIC和MBC结果

1#鼠伤寒沙门氏菌M-H肉汤试管肉汤澄清，2～8#试管肉汤浑浊，9#阳性对照管肉汤浑浊，10#阴性对照管肉汤澄清。对应的营养琼脂平板上，1#平板无细菌生长，2#平板呈零星生长，3#平板呈分散生长，4～8#平板细菌连片生长，9#平板细菌连片生长，10#平板无细菌生长，结果见表2。白头翁汤剂对于鼠伤寒沙门氏菌的MIC=0.125 g/mL、MBC=0.5 g/mL。

2.2.2 志贺氏菌的MIC和MBC结果

1、2 #志贺氏菌M-H肉汤试管肉汤澄清，3～8#试管肉汤浑浊，9#阳性对照管肉汤浑浊，10#阴性对照管肉汤澄清。对应的营养琼脂平板上，1和2#平板无细菌生长，3#平板呈零星生长，4#平板呈分散生长，5～8#平板细菌连片生长，9#平板细菌连片生长，10#平板无细菌生长，结果见表2。白头翁汤剂对于志贺氏菌的MIC=0.0625 g/mL、MBC=0.25 g/mL。

2.2.3 金黄色葡萄球菌的MIC和MBC结果

1、2 #金黄色葡萄球菌M-H肉汤试管肉汤澄清，2～8#试管肉汤浑浊，9#阳性对照管肉汤浑浊，10#阴性对照管肉汤澄清。对应的营养琼脂平板上，1和2#平板无细菌生长，3～6#平板呈分散生长，但随着药液浓度的稀释，金黄色葡萄球菌菌落数递增， 7、8#平板上金黄色葡萄球菌连片生长，9#平板细菌连片生长，10#平板无细菌生长，结果见表2。白头翁汤剂对于金黄色葡萄球菌的MIC=0.015625 g/mL、MBC=0.25 g/mL。

3 讨论

微生物耐药性和抗生素滥用以及不断增加的不良反应已成为全球关注的严峻问题，许多新的病原微生物和耐药菌的产生对人类和动物健康造成极大威胁。因此，防止微生物耐药性产生和寻找特效抗菌药物成为当务之急[16]。我国中草药资源丰富，长期使用较少产生耐药性，不易出现残留、抗药性、毒副作用，具有安全性和可靠性，是其他抗生素无可比拟的[17]。

表1 白头翁汤剂的K-B纸片抑菌结果

表2 白头翁汤剂对3种致病菌的MIC、MBC测定结果

本实验以鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌为供试菌，分别来测试白头翁汤剂的抑菌活性。从结果中可以看出，白头翁汤剂对志贺氏菌和金黄色葡萄球菌有明显的效果，对鼠伤寒沙门氏菌效果较好，且抑菌效果与药汤剂浓度无特定的比例关系。这可能是由于中草药含有多种成分，而各成分的活性强度（抗菌能力）有所不同，以及抑菌机理的不同所致。

本实验白头翁汤剂对挑选的3种致病菌的抗菌效果不能简单的以药物的MIC和MBC来评价，而忽略了机体自身免疫机能的影响。本实验采用体外环境作为抑菌背景，而药物的作用环境大多在机体内部[18]，抑菌效果必然有所差异，需要后续实验进行进一步的论证。可以预见的是，利用中草药防治细菌性疾病，减少抗生素及化学合成药物的使用，降低药物残留对人类的危害，将是发展现代中药学的必然趋势。