复方党参药对固态发酵的实验研究

吴金梅，胡迎利

(河南牧业经济学院，河南 郑州 450046)

微生物发酵技术不仅可以提高中药活性成分含量、提高药效、降低毒副作用，同时中药中的成分可促进或抑制其次生代谢产物的产生，生产出包含多种活性成分的制剂或新药[1]。中医认为，党参与黄芪或红芪配伍，具有补中益气、健脾益肺、提高生长性能、增强机体免疫力与抗病能力等功效。本实验利用地衣芽孢杆菌和屎肠球菌的相互促进作用，在不添加C源、N源、矿物质等外源营养因子的条件下，对中药药对党参黄芪(11)和党参红芪(11)进行固态发酵，探究复合益生菌固态发酵技术对中药主要活性成分多糖转化的影响，研究中药发酵物中小肽含量变化规律，为中草药固态发酵技术和开发中药微生态产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

地衣芽孢杆菌与屎肠球菌由北京龙科方舟生物工程技术有限公司提供；党参、黄芪、红芪 (仲景堂中药批发有限公司，1年生)；无水葡萄糖标准品(贵州迪大生物科技有限责任公司)；其它试剂均为分析纯。

1.2 培养基准备

(1)MRS液体培养基：MRS肉汤(北京奥博星生物技术有限责任公司)，在温度121 ℃条件下灭菌15 min；(2)MRS固体培养基：MRS肉汤、1.5%琼脂粉，在温度121 ℃条件下灭菌20 min；(3)LB液体培养基：蛋白胨1.0%、酵母浸粉0.5%、氯化钠0.5%，在温度121 ℃条件下灭菌20 min；(4)LB固体培养基：蛋白胨1.0%、酵母浸粉0.5%、氯化钠0.5%、琼脂粉1.5%，在温度121 ℃条件下灭菌20 min。

1.3 益生菌种子液制备

(1)屎肠球菌种子液制备：将冷冻保存的屎肠球菌菌种接种于MRS固体平皿中，37 ℃静置培养24 h；待形成菌落后挑取单个菌落接种于MRS液体培养基中(用500 mL摇瓶，每瓶装量150 mL，共做5瓶)，在温度37 ℃条件下静置培养12 h，即得屎肠球菌种子液。

(2)地衣芽孢杆菌种子液制备：将冷冻保存的地衣芽孢杆菌菌种接种于LB固体平皿中，37 ℃静置培养18 h；待形成菌落后挑取单个菌落接种于LB液体培养基中(用500 mL摇瓶，每瓶装量150 mL，共做5瓶)，在温度37 ℃、转速200 rpm条件下培养12 h，即得地衣芽孢杆菌种子液。

1.4 中药基质准备

1.5 固态发酵

1.6 多糖的含量测定

(1)多糖的提取与精制：取各实验组发酵产物适量，加入石油醚150 mL(石油醚沸程为60 ℃-90 ℃)，70 ℃回流2 h(脱去表面脂肪)，过滤，弃滤液。取滤渣，加95%乙醇回流(脱去色素和去除小分子的糖)，滤过后，取滤渣用水回流浸提(浸提温度80 ℃，浸提时间1 h,浸提次数2次，料液比112)，重复两次，合并滤液，待滤液常温后，加入乙醇使醇浓度为80%，静置过夜(4 ℃)，过滤，沉淀加适量的水溶解，加入乙醇使醇浓度为80%，再静置过夜(4 ℃)，过滤，沉淀加适量的水溶解。除蛋白，样液与试剂的体积比为11，氯仿与正丁醇的体积比为41，振摇30 min,静置20 min，反复此操作，离心，沉淀加适量的水溶解,加入乙醇使醇浓度为80%，再静置过夜(4 ℃)，抽滤，得浸膏，备用。

(2)葡萄糖标准溶液制备：精密称取五氧化二磷干燥至恒重的葡萄糖对照品10 mg,置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀备用，得0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液。

(3)葡萄糖标准曲线绘制：精密吸取上述葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL于具塞试管中，分别加蒸馏水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL,分别给试管编号。各试管加苯酚试液1.0 mL，摇匀，迅速加浓硫酸5 mL振摇2 min后，于沸水浴中加热15 min，取出置冷水中冷却至室温。同时吸取1.0ml蒸馏水于具塞试管中同法操作(自加苯酚试液1.0ml起)为空白，于490 nm处测吸光度分别为0.003、0.165、0.394、0.590、0.750、1.004，以浓度C为横坐标，以吸光度A为纵坐标，得回归方程：A=9.937c-0.012,R2=0.996, 线性关系如下图。线性关系较好。

图1 葡萄糖溶液标准曲线

(4)样品中多糖的含量测定：采用苯酚 - 硫酸法[2]将多糖浸膏溶于500 mL容量瓶中，加水适量，80 ℃超声提取30 min，过滤，吸取10 mL滤液于100 mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀备用。取多糖供试品溶液，精密吸取1.0 mL于具塞试管中，按“标准曲线”项下的操作(自加苯酚1.0 mL起)，测定490 nm处的吸光度，由回归方程计算供试品中葡糖糖的浓度，由标准曲线法测定多糖的含量。

1.7 样品中小肽的含量测定

准确称取样品4 g于250 mL烧杯中，准确加入15%三氯乙酸溶液50 mL，混合均匀，静置5 min，以中速定性滤纸过滤，弃去少许初始滤液，将滤液转移至离心管，在4000 r/min下离心10 min，准确移取上清液10 mL于消化管中，按全量法[3]粗蛋白质测定方法测定其小肽含量。

2 结果与分析

2.1 样品中多糖含量测定

图2 中草药固态发酵多糖含量变化曲线图(横坐标为发酵时间(h)，纵坐标为多糖含量(%))

由图2可以看出，本实验中党参红芪药对的多糖含量高于党参黄芪药对。两组药对固态发酵后多糖量均增加，至192小时达到高峰，192小时后逐渐减少到发酵终点。说明在固态发酵前期，中草药基质自身的营养因子能够满足屎肠球菌与地衣芽孢杆菌发酵所需的营养。在酶的作用下，中草药原料中的某些物质转化为多糖。192小时后减少可能是因为随着发酵时间的延长，需要消耗糖类作为C源维持正常的发酵过程。

3.2 样品中小肽含量测定

由图3可以看出，本实验两组药对的小肽含量差别不大。两组药对固态发酵后小肽含量均在某段时间内递增或递减，至192小时达到第一个高峰。可能因为中药能促进固态发酵物中地衣芽孢杆菌和屎肠球菌的表达与生长，在酶的作用下将菌体蛋白转化为小肽的缘故。至384小时小肽含量增加至第二个高峰，主要是因为发酵过程中一些大分子蛋白质被降解为小肽。

图3 发酵前后小肽含量变化曲线图(横坐标为发酵时间(h)，纵坐标为小肽含量(%))

3 讨论

中药党参、黄芪和红芪是常用的补益类中药，其主要活性成分多糖类物质可以提高机体免疫力，其多糖含量的多寡直接影响药效的高低。国内外研究中，对党参、黄芪单味中药的微生物发酵研究居多，对党参、黄芪和红芪复方制剂的益生菌发酵研究较少，而且党参、黄芪、红芪药对的配伍在医药、养殖生产、食品、保健等多个领域均很常用，因此，对党参黄芪药对和党参红芪药对的研究具有重要意义。

本实验运用具有明显益生特性的屎肠球菌和地衣芽孢杆菌复配技术，在不添加C源、N源、矿物质等外源营养因子的条件下，对中药党参黄芪药对和党参红芪药对进行固态发酵。结果发现：党参红芪药对比党参黄芪药对的多糖含量高。两药对固态发酵后多糖与小肽量均增加，第8-9日逐渐达到高峰，但党参黄芪药对小肽量升高幅度较大。综合考虑两个药对多糖与小肽的含量变化，认为党参黄芪药对微生态产品在养殖业生产中更具有开发价值。固态发酵时间为7-8天，其自身的营养因子能够满足屎肠球菌与地衣芽孢杆菌发酵所需的营养。